丹參酮ⅡA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549 生物學(xué)行為的影響初探*

王 布，鄒 芳，袁勝芳，項(xiàng)保利，張志華，顧 鑫，牛向欣，趙建清

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000）

2020 年全球惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌是惡性腫瘤患者的主要死因之一，其發(fā)病率約為11.4%，僅次于乳腺癌［1］。肺腺癌為非小細(xì)胞肺癌（約占肺癌的80%）最常見(jiàn)亞型（約占50%）［2-3］。非小細(xì)胞肺腺癌患者早期無(wú)特征性表現(xiàn)，確診時(shí)多處于中晚期，且預(yù)后較差、生存時(shí)間一般較短?，F(xiàn)有治療手段常伴明顯的副作用，致使患者機(jī)能下降、生活受限。研究中醫(yī)藥的抗腫瘤機(jī)制對(duì)指導(dǎo)臨床用藥及開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物具有積極意義。丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血、散瘀作用［4］，其主要成分丹參酮ⅡA可影響多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，抑制其增殖、推動(dòng)程序性死亡［5-8］。本研究中初步探討了丹參酮ⅡA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549 生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：Eculipse Ts2 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Spectra Max M5 型酶標(biāo)儀（美國(guó)MD 公司）；BBD6220型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司）；AriaⅢ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

試藥：丹參酮ⅡA（北京百靈威科技有限公司，批號(hào)為L(zhǎng)UC0Q43，含量97%）；二甲基亞砜（DMSO，武漢賽奧斯生物科技有限公司，批號(hào)為B326BA3887，含量≥99.5%）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)分別為B01124701，AD24221175）；Trizol 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)為15596-026）；Annexin V/碘化丙啶（PI）雙染試劑盒（美國(guó)BD 公司，批號(hào)為9312842）；胎牛血清（FBS）培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)為42Q0682K）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT -qPCR）試 劑 盒（ 美 國(guó) Promega 公 司，批 號(hào) 為0000497768）；Transwell小室（美國(guó)Corning公司，批號(hào)為3412）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）溶液（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)為M2128，質(zhì)量濃度為5 mg/mL）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、整合素（integrin）α2、integrin β1、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）B1、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的抗體（上海艾博抗有限公司，批號(hào)分別為ab181286，ab137867，ab133557，ab136524，ab32072，ab4051）。

細(xì)胞：人肺腺癌A549細(xì)胞株（上海奧陸生物科技有限公司）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)與分組：將A549 細(xì)胞置含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)培養(yǎng)基）中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以酶消化法（0.25%EDTA 胰蛋白酶溶液）傳代，培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（A組，等體積培養(yǎng)基），順鉑組（B 組，10 μg/mL 順鉑），丹參酮ⅡA（臨用前以DMSO 溶解）低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組，5，10，20 μmol/L）。

細(xì)胞增殖能力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為4×103個(gè)/孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物或培養(yǎng)基10 μL 處理，均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h，加入20 μL MTT 溶液培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，以酶標(biāo)儀在504 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD），并計(jì)算增殖率。

細(xì)胞遷移能力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為3×105個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后在孔內(nèi)劃3 條劃痕，用PBS 清洗并去除懸浮細(xì)胞，各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物或培養(yǎng)基處理，平行3 次，用倒置顯微鏡于0（給藥即刻），24 h時(shí)取樣拍照，并計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞侵襲能力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗滌，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/孔。取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell 上室中，各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物或培養(yǎng)基處理，平行3 次；取培養(yǎng)基加入Transwell 下室。培養(yǎng)24 h 后，上室內(nèi)的細(xì)胞用棉簽擦去，以甲醇固定下室細(xì)胞，再用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)并記錄侵襲細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期：采用流式細(xì)胞術(shù)。各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物或培養(yǎng)基處理24 h，取100 μL 細(xì)胞懸液，加入10 μL PI、5 μL Annexin V-FITC 混勻，室溫下避光培養(yǎng)30 min。加入5 μL PI后繼續(xù)避光培養(yǎng)10 min。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡率。用乙醇固定細(xì)胞，PI染色處理后的RNA，再以流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞DNA 含量，統(tǒng)計(jì)各周期細(xì)胞占比。2個(gè)實(shí)驗(yàn)均平行3次。

mRNA和蛋白表達(dá)水平：取經(jīng)藥物或培養(yǎng)基處理后的各組A549 細(xì)胞，提取mRNA，嚴(yán)格按RT - qPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。采用Western blot法，取經(jīng)相應(yīng)藥物或培養(yǎng)基處理后的各組A549細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白，以BCA 法檢測(cè)蛋白濃度；電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入MMP-2（1∶500，V/V），MMP-9（1∶500，V/V），integrin α2（1∶200，V/V），integrin β1（1∶200，V/V），Cyclin B1（1∶200，V/V），Caspase-3（1∶200，V/V）的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜，加入二抗繼續(xù)孵育2 h；ECL發(fā)光液顯色，以凝膠成像儀成像，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況

與A 組比較，B 組及C1組、C2組、C3組細(xì)胞處理24，48，72 h 時(shí)的增殖率均顯著降低（P＜0.05），且增殖率隨丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度的增加而降低。詳見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率比較（±s，%，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation rate in each group（±s，%，n=6）

表1 各組細(xì)胞增殖率比較（±s，%，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation rate in each group（±s，%，n=6）

注：與A組比較，*P ＜0.05。表2至表5同。Note：Compared with those in the group A，*P ＜0.05（for Tab.1 - 5）.

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值72 h 1.35±0.19 0.61±0.03*1.10±0.19*0.87±0.04*0.63±0.02*38.704 0.000劑量（μg/mL）0 10 5 10 20 24 h 0.95±0.13 0.55±0.04*0.77±0.10*0.66±0.06*0.53±0.03*27.330 0.000 48 h 1.08±0.14 0.60±0.04*0.93±0.07*0.77±0.05*0.59±0.05*46.967 0.000

2.2 細(xì)胞遷移及侵襲情況

與A 組比較，B組及C1組、C2組、C3組處理24 h的遷移細(xì)胞及侵襲細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P＜0.05），且兩者數(shù)量隨丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度的升高而減少。詳見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)比較（±s，個(gè)，n=3）Tab.2 Comparison of the numbers of migrating and invading cells in each group（±s，cell，n=3）

表2 各組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)比較（±s，個(gè)，n=3）Tab.2 Comparison of the numbers of migrating and invading cells in each group（±s，cell，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值劑量（μg/mL）0 10 5 10 20遷移細(xì)胞數(shù)134.50±7.66 62.83±3.19*116.67±5.47*82.33±5.28*65.50±3.45*219.878 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)117.33±6.41 50.17±3.82*95.83±4.26*67.67±4.32*48.83±3.43*257.353 0.000

2.3 細(xì)胞凋亡情況

與A 組比較，B 組及C1組、C2組、C3組細(xì)胞處理24 h時(shí)的凋亡率均顯著升高（P＜0.05），且凋亡率隨丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度的增加而升高。詳見(jiàn)表3、圖1。

圖1 流式細(xì)胞圖Fig.1 Results of flow cytometry detection

表3 各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布情況比較（±s，%，n=3）Tab.3 Comparison of apoptosis rate and cell cycle distribution in each group（±s，%，n=3）

表3 各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布情況比較（±s，%，n=3）Tab.3 Comparison of apoptosis rate and cell cycle distribution in each group（±s，%，n=3）

組別凋亡率細(xì)胞周期劑量（μg/mL）0 10 5 10 20 A組B組C1組C2組C3組F值P值3.63±1.38 48.57±4.50*24.53±3.45*36.12±4.78*49.96±4.48*143.522 0.000 G0/G1期56.42±2.13 83.28±0.85*67.77±1.46*75.54±1.04*84.01±1.25*398.523 0.000 S期26.48±1.36 12.45±0.86*19.06±1.32*15.98±0.96*11.88±1.21*158.429 0.000 G2/M期17.11±1.18 4.27±0.19*13.17±0.97*8.48±0.68*4.12±0.15*338.795 0.000

2.4 細(xì)胞周期分布

與A 組比較，B組及C1組、C2組、C3組處理24 h時(shí)的G0/G1期細(xì)胞占比均顯著升高（P＜0.05），且細(xì)胞占比隨丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度的增加而增加；B組及C1組、C2組、C3組的S 期、G2/M 期細(xì)胞占比均顯著減少（P＜0.05），且隨丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度的增加而減少。詳見(jiàn)表3、圖2。

圖2 細(xì)胞周期分布Fig.2 Distribution of cell cycles

2.5 mRNA 及蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組及C1組、C2組、C3組的MMP - 2，MMP - 9，integrin α2，integrin β1，Cyclin B1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），且隨丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度的增加而降低；B組及C1組、C2組、C3組細(xì)胞Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），且隨丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度的增加而升高。詳見(jiàn)表4、表5、圖3。

圖3 蛋白表達(dá)印跡圖Fig.3 Western blot of protein expression

表4 各組細(xì)胞mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of mRNA expression levels in each group（±s，n=3）

表4 各組細(xì)胞mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of mRNA expression levels in each group（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值Caspase-3 1 4.87±0.41*1.87±0.47*3.30±0.30*5.03±0.34*158.582 0.000 MMP-2 1 0.66±0.03*0.92±0.03*0.73±0.12*0.65±0.04*45.319 0.000 MMP-9 1 0.48±0.04*0.93±0.02*0.64±0.03*0.46±0.03*470.624 0.000 integrin α2 1 0.39±0.03*0.65±0.05*0.61±0.02*0.37±0.01*478.055 0.000 integrin β1 1 0.56±0.03*0.94±0.01*0.62±0.02*0.55±0.04*499.374 0.000 Cyclin B1 1 0.36±0.05*0.71±0.09*0.48±0.05*0.36±0.07*129.818 0.000

表5 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression levels in each group（±s，n=3）

表5 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression levels in each group（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值MMP-2 1.03±0.02 0.61±0.04*0.87±0.03*0.69±0.05*0.63±0.03*149.906 0.000 MMP-9 1.02±0.03 0.40±0.05*0.89±0.02*0.60±0.04*0.41±0.02*395.394 0.000 integrin α2 0.97±0.03 0.37±0.03*0.62±0.04*0.57±0.03*0.34±0.02*421.856 0.000 integrin β1 1.02±0.02 0.49±0.04*0.88±0.03*0.59±0.02*0.48±0.05*304.908 0.000 Cyclin B1 0.98±0.02 0.34±0.04*0.67±0.06*0.46±0.04*0.33±0.06*200.984 0.000 Caspase-3 1.02±0.01 4.97±0.39*1.74±0.42*3.18±0.34*5.12±0.41*168.790 0.000

3 討論

肺癌由支氣管黏膜病變引發(fā)，其病因病機(jī)復(fù)雜。其中非小細(xì)胞肺腺癌特征為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)密集，且在早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移。化學(xué)藥物治療（簡(jiǎn)稱(chēng)化療）、手術(shù)切除及放射治療（簡(jiǎn)稱(chēng)放療）是其常規(guī)治療方法。但現(xiàn)有臨床治療方案無(wú)法顯著改善肺癌患者的生存率，只能延緩病程發(fā)展。丹參酮ⅡA作為丹參的活性成分之一，常用于保護(hù)心腦血管，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)丹參及其活性成分具有抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示，C1組、C2組、C3組A549細(xì)胞的增殖率均明顯降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少，且與丹參酮ⅡA的質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)；C1組、C2組、C3組A549 細(xì)胞的凋亡率均明顯升高，且與丹參酮ⅡA的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在一定程度上證明了丹參酮ⅡA的抗腫瘤作用。

細(xì)胞周期分為分裂期和為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備的分裂間期，分裂間期受基因表達(dá)控制可合成多種蛋白對(duì)細(xì)胞的代謝活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控。在DNA 合成的前中后3 個(gè)階段均有調(diào)控細(xì)胞周期的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)，且均配備嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制［9］。其中Cyclin 蛋白為調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵機(jī)制之一，可通過(guò)促進(jìn)G2/M 期轉(zhuǎn)換，進(jìn)而加快細(xì)胞周期的進(jìn)展，其表達(dá)失控與細(xì)胞的惡性增殖關(guān)系密切［10］。細(xì)胞發(fā)生程序性死亡（即凋亡）的過(guò)程有助于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是機(jī)體控制細(xì)胞數(shù)異常增多的理想方法。Caspase-3 在細(xì)胞凋亡中起重要作用，是執(zhí)行過(guò)程的關(guān)鍵酶，可被外源性或內(nèi)源性路徑激活，林晉等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)升高Caspase - 3 的表達(dá)水平來(lái)推動(dòng)人骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。提示Caspase - 3 的表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡增加，可能也是丹參酮ⅡA發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力使其能轉(zhuǎn)移到除原發(fā)病灶外的其他臟器，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，MMP - 2 和MMP- 9 水平升高的情況存在于多種腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，且兩者的水平變化可影響發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞數(shù)。黃敏等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，瘤易感性候選基因2（CASC2）可通過(guò)降低MMP - 2 蛋白表達(dá)而抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。左文娜等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中MMP-9 呈高表達(dá)狀態(tài)，降低MMP-9 表達(dá)水平可抑制喉癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)喉癌細(xì)胞的凋亡。熊濤等［14］的研究證明，毛萼乙素可通過(guò)調(diào)控lncRNA CPS1-IT1表達(dá)，減少M(fèi)MP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。integrin 作為黏附分子，存在于細(xì)胞表面。細(xì)胞的生物學(xué)行為可通過(guò)integrin 傳導(dǎo)的雙向信號(hào)變化來(lái)調(diào)節(jié)。研究表明，integrin α2和integrin β1在前列腺癌［15］、宮頸癌［16］等不同腫瘤細(xì)胞株中呈高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。本研究結(jié)果顯示，與A組比較，C1組、C2組、C3組A549細(xì)胞MMP-2，MMP-9，integrin α2，integrin β1，Cyclin B1 mRNA 表達(dá)水平均明顯降低，且與丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)；Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，且與丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。說(shuō)明丹參酮ⅡA對(duì)A549細(xì)胞的抗腫瘤作用可能通過(guò)調(diào)控上述mRNA表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，丹參酮ⅡA可抑制A549 細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP - 2，MMP - 9，integrin α2，integrin β1，Cyclin B1 的表達(dá)和上調(diào)Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。