circPTPRA靶向miR-140-5p調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制研究

張 兵,王孝玉,朱亞輝

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是臨床常見的一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病,隨著疾病的發(fā)展病人關(guān)節(jié)骨與軟骨組織逐漸被破壞,甚至致使病人殘疾,研究[1-2]發(fā)現(xiàn)滑膜成纖維細(xì)胞過度增殖及遷移可促進(jìn)RA的發(fā)展。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是由5′端與3′端以共價(jià)鍵結(jié)合形成的一種環(huán)狀RNA分子,其在RA或滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)異常,并可能調(diào)控細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移等過程[3-4]。circPTPRA高表達(dá)可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展[5]。但circPTPRA與RA的相關(guān)研究尚鮮見報(bào)道。生物信息學(xué)預(yù)測顯示circPTPRA與miR-140-5p存在結(jié)合位點(diǎn),研究[6]表明miR-140-5p在RA滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),其可抑制細(xì)胞增殖及炎性因子的分泌。但circPTPRA/miR-140-5p分子軸在RA發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未闡明。因此,本研究主要探討circPTPRA通過靶向調(diào)控miR-140-5p而影響RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年10月至2020年1月期間于本院關(guān)節(jié)外科行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的26例RA病人為研究對象,所有病人均符合2010ACR/EULAR頒布的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn),其中男16例,女10例,年齡52～67歲,平均年齡(58.59±7.46)歲,術(shù)中切除滑膜組織置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。選取同期于本院接受關(guān)節(jié)手術(shù)的外傷病人26例為對照,所有病人均為外傷所致且均未患有RA,其中男16例,女10例,年齡45～66歲,平均年齡(57.26±3.25)歲。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清購自美國Gibco;MTT、DMSO購自美國Sigma;Lipofectamine2000、Transwell小室購自北京索萊寶;Trizol試劑購自美國Invitrogen;逆轉(zhuǎn)錄試劑及qRT-PCR試劑均購自美國Thermo Fisher;si-NC、si-circPTPRA、miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-140-5p購自廣州銳博生物;pcDNA3.1、pcDNA-circPTPRA購自上海吉瑪;兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9與二抗購自美國CST。

1.3 方法

1.3.1 原代分離培養(yǎng)RA滑膜成纖維細(xì)胞 取出病人的滑膜組織,PBS浸泡后沖洗,剪去滑膜附屬的外周組織,將滑膜組織剪接呈小塊(2 mm3),PBS洗滌后將組織塊轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min,向培養(yǎng)瓶中加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 mL,繼續(xù)培養(yǎng),用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),選用第3～4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[7]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 RA滑膜成纖維細(xì)胞按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板,用不含胎牛血清的培養(yǎng)液分別稀釋si-NC、si-circPTPRA、miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC與si-circPTPRA、anti-miR-140-5p與si-circPTPRA室溫孵育5 min(A液),用不含胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(B液),A液與B液充分混勻后按照每孔400 μL的密度加入6孔板中,分別記為si-NC組、si-circPTPRA組、miR-NC組、miR-140-5p組、anti-miR-NC+si-circPTPRA組、anti-miR-140-5p+si-circPTPRA組。同時(shí)將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的RA滑膜成纖維細(xì)胞記為NC組。

1.3.3 qRT-PCR檢測circPTPRA、miR-140-5p的表達(dá)水平 研磨RA滑膜成纖維細(xì)胞與正?；こ衫w維細(xì)胞后用Trizol試劑提供細(xì)胞總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以2 μL cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),按照試劑盒說明書操作并用2-ΔΔCt法分析circPTPRA、miR-140-5p的表達(dá)水平。

1.3.4 MTT檢測細(xì)胞增殖 取各組RA滑膜成纖維細(xì)胞按照每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板,于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,分別進(jìn)行MTT反應(yīng)并用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 收集RA滑膜成纖維細(xì)胞(5×105個(gè)/毫升)加入上室中(200微升/孔),在小室加入500 μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液,孵育24 h后取出小室,PBS洗滌后用甲醇固定20 min,結(jié)晶紫染色液染色15 min,用水沖洗后晾干,于顯微鏡下拍照,隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測circPTPRA與miR-140-5p的靶向關(guān)系 構(gòu)建包含miR-140-5p潛在結(jié)合序列的circPTPRA重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒WT-circPTPRA及包含突變結(jié)合序列的重組質(zhì)粒MUT-circPTPRA,RA滑膜成纖維細(xì)胞按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于12孔板,分別轉(zhuǎn)染1.5 μg重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-140-5p mimics(100 nmol/L)或miR-NC(100 nmol/L),24 h后檢測螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性,二者熒光素酶活性比值可表示circPTPRA與miR-140-5p的結(jié)合能力。

1.3.7 Western blotting檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá) 取各組RA滑膜成纖維細(xì)胞加入100 μL蛋白裂解液(1 μL蛋白酶抑制劑與1 μL磷酸酶抑制劑)提取細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,蛋白樣品煮沸后變性,按照每孔50 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng),分離后蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,用8%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1.5 h,加入CyclinD1(1∶800)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后二抗(1∶2 000)孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光法顯示條帶,用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs中circPTPRA及 miR-140-5p表達(dá)情況 與Control組比較,RA-FLSs組circPTPRA的表達(dá)量升高,miR-140-5p的表達(dá)量降低(P<0.01)(見表1)。

表1 RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs中circPTPRA及miR-140-5p表達(dá)情況

2.2 低表達(dá)circPTPRA對RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與si-NC組比較,si-circPTPRA組細(xì)胞活力降低,遷移細(xì)胞數(shù)減少,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P<0.05)(見圖1、表2)。

2.3 miR-140-5p對RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與miR-NC組比較,miR-140-5p組細(xì)胞活力降低,遷移細(xì)胞數(shù)減少,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P<0.01)(見圖2、表3)。

2.4 circPTPRA靶向miR-140-5p circPTPRA與miR-140-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖3)。miR-140-5p過表達(dá)可明顯降低野生型載體WT-circPTPRA的熒光素酶活性(P<0.01)(見表4)。circPTPRA可負(fù)向調(diào)控miR-140-5p的表達(dá)(P<0.05)(見表5)。

2.5 anti-miR-140-5p逆轉(zhuǎn)si-circPTPRA對RA-FLSs增殖和轉(zhuǎn)移的影響 與anti-miR-NC+si-circPTPRA組比較,anti-miR-140-5p+si-circPTPRA組細(xì)胞活力升高,遷移細(xì)胞數(shù)增多,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P<0.01)(見圖4、表6)。

表2 低表達(dá)circPTPRA對RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs增殖和轉(zhuǎn)移的影響

表3 miR-140-5p對RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs增殖和轉(zhuǎn)移的影響

表4 雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-140-5p的表達(dá)

3 討論

circRNA與線性RNA不同,其不易被降解且具有組織、時(shí)序特異性,研究[8-10]發(fā)現(xiàn)circRNA在RA病人中表達(dá)異常,并可能作為臨床診斷RA的潛在生物標(biāo)志物,但circRNA在RA形成及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

表6 anti-miR-140-5p逆轉(zhuǎn)si-circPTPRA對RA-FLSs增殖和轉(zhuǎn)移的影響

circPTPRA在膀胱癌中表達(dá)下調(diào),并可通過充當(dāng)miR-636的海綿分子而上調(diào)KLF9表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌的發(fā)展進(jìn)程[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)circPTPRA可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。但circPTPRA在RA中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果顯示,RA滑膜成纖維細(xì)胞中circPTPRA的表達(dá)量升高,干擾circPTPRA表達(dá)可明顯降低RA滑膜成纖維細(xì)胞活力及CyclinD1蛋白水平。研究[13]表明CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物而正向調(diào)控細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果提示干擾circPTPRA表達(dá)可抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖。MMP2、MMP9可降解細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)果顯示,干擾circPTPRA表達(dá)后RA滑膜成纖維細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)減少,MMP2、MMP9蛋白水平降低,提示干擾circPTPRA表達(dá)可抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞遷移。

為進(jìn)一步探究circPTPRA在RA發(fā)展過程中的作用機(jī)制,本研究證實(shí)RA滑膜成纖維細(xì)胞中circPTPRA可靶向結(jié)合miR-140-5p。miR-140-5p可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[15]。研究[16-17]顯示,miR-140-5p通過靶向FUT1抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡;miR-140-5p過表達(dá)通過下調(diào)Toll樣受體4而抑制脂多糖誘導(dǎo)的人椎間盤炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,RA滑膜成纖維細(xì)胞中miR-140-5p的表達(dá)量降低,miR-140-5p過表達(dá)可明顯降低RA滑膜成纖維細(xì)胞活力及遷移能力,而抑制miR-140-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾circPTPRA表達(dá)對RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用。

綜上所述,RA滑膜成纖維細(xì)胞中circPTPRA的表達(dá)量升高,而miR-140-5p的表達(dá)量降低,干擾circPTPRA表達(dá)可通過上調(diào)miR-140-5p的表達(dá)而抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖及遷移,circPTPRA可能作為RA診斷與治療的潛在靶點(diǎn)。本研究不足之處在于circPTPRA是否可通過靶向調(diào)控其他miRNA表達(dá)而參與RA發(fā)生及發(fā)展過程中尚未可知。未來將進(jìn)一步研究證實(shí)circPTPRA/miR-140-5p分子軸在RA發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制。