Periostin調(diào)控AKT信號通路激活胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

金良玉,耿志軍,張小鳳,宋 雪,李 靜

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,是全球第三大癌癥死亡原因[1]。我國癌癥報告顯示,胃癌位居我們惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第2位,僅次于肺癌,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)以及公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[2]。Periostin(POSTN)為成骨細(xì)胞特異性因子2[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)POSTN參與細(xì)胞黏附、結(jié)締組織的發(fā)育、細(xì)胞存活、血管形成、組織修復(fù)和再生。且POSTN在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和卵巢癌等癌癥中過表達(dá)[5]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在癌細(xì)胞的增殖、浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[6],以及蛋白激酶B(AKT)信號通路在胃癌的癌變和細(xì)胞生存控制過程中的發(fā)揮著重要作用[7]。本研究探討了POSTN調(diào)控AKT信號通路激活胃癌細(xì)胞EMT的機(jī)制。現(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃組織收集于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科,并已獲得病人的知情同意。人胃癌細(xì)胞MGC 803(購自北京協(xié)和細(xì)胞庫)、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)、過表達(dá)和敲除POSTN基因的慢病毒(吉凱基因)、Trizol(美國Invitrogen公司)、PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)、SYBR Green PCR Master Mix和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、MTT試劑和結(jié)晶紫染料(北京索萊寶生物科技有限公司)、Transwell小室(美國corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光 將胃癌組織置于4%多聚甲醛固定、脫水機(jī)脫水、石蠟包埋、制片、烤片和抗原修復(fù)后,孵育POSTN(stanta cruz biotechnology,1∶100)和CD44(abcam,1∶200),洗滌3次后,孵育Alexa Fluor?594標(biāo)記兔抗山羊IgG(H+L)和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋生物有限公司,1∶200),洗滌后滴加DAPI(thermo)對細(xì)胞核進(jìn)行染色,置于激光共聚焦顯微鏡(Leica,SP8)采集圖片。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MGC 803細(xì)胞移入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于含有5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將MGC 803細(xì)胞種植于6孔板中,提前1 h換新鮮的培養(yǎng),分別滴加過表達(dá)和敲除POSTN基因的慢病毒溶液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,更換新鮮的培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 d后,更換含有5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選,收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 抑制劑的孵育 將細(xì)胞種植6孔板中,更換新鮮的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,更換含有LY294002(sigma,10 μmol/L)的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 RT-qPCR 采用Trizol法提取MGC 803、過表達(dá)POSTN基因的MGC 803和敲除POSTN基因的MGC 803以及添加LY294002抑制劑的胃癌細(xì)胞,按照PCR說明書進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。GAPDH作為內(nèi)參,所用的引物序列見表1。

1.2.6 Western blotting 采用RAPI裂解液提取胃癌細(xì)胞,經(jīng)BCA蛋白定量、loading buffer稀釋和煮沸變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳與轉(zhuǎn)膜后,孵育POSTN(1∶1 000)、CD44(1∶1 000)、α-sma(CST,1∶1 000)、VIM(CST,1∶1 000)、snail+slug(CST,1∶1 000)、E-cad(CST,1∶1 000)和GAPDH(CST,1∶1 000),在經(jīng)過氧化物酶連接的二抗(北京中杉金橋生物有限公司,1∶2 000)孵育,經(jīng)暗室曝光并采集圖片。

1.2.7 CCK-8 將胃癌細(xì)胞種植于96孔板中,每孔1×103個細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μL的CCK-8試劑,培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)4 h,在490 nm下經(jīng)酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD)值。

1.2.8 Transwell遷移 消化稀釋胃癌細(xì)胞,用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,取4×104/mL的細(xì)胞100 μL種植于Transwell小室中,在24孔板中加入1 mL的完全培養(yǎng),并種植好細(xì)胞的Transwell小室置于24孔板中,培養(yǎng)24 h后,再經(jīng)多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色后,再顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野采集圖片并統(tǒng)計分析。侵襲:冰上完全溶解Matrigel基質(zhì)膠,取40 μL加入預(yù)冷的Transwell小室中;其余的操作步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 POSTN在胃癌病人的癌旁、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)水平比較 與癌旁組織相比,原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中POSTN的表達(dá)均明顯地升高,以及轉(zhuǎn)移灶組織中POSTN表達(dá)也明顯高于原發(fā)灶組織,且POSTN的表達(dá)與CD44(腫瘤干性標(biāo)志物)有共定位現(xiàn)象(見圖1)。

2.2 POSTN在不同臨床分期的胃癌原發(fā)灶組織中表達(dá)水平 免疫熒光顯示胃癌原發(fā)灶組織臨床分期越晚,POSTN的表達(dá)越高,且POSTN的表達(dá)與CD44也有共定位現(xiàn)象(見圖2)。

2.3 過表達(dá)和敲除POSTN基因?qū)GC 803細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的影響 與對照組相比,過表達(dá)POSTN基因MGC 803的細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力明顯地升高;敲除POSTN基因MGC 803的細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力細(xì)胞明顯地降低(P<0.01)(見圖3和表2～4)。

2.4 過表達(dá)和敲除POSTN基因?qū)GC 803細(xì)胞EMT的影響 與對照組相比,過表達(dá)POSTN基因MGC 803的間質(zhì)標(biāo)志物(α-sma、VIM、snail和slug)的表達(dá)升高,上皮標(biāo)注物E-Cadherin表達(dá)下降;而敲除POSTN基因MGC 803的間質(zhì)標(biāo)志物(α-sma、VIM、snail和slug)的表達(dá)下降,上皮標(biāo)注物E-Cadherin表達(dá)升高(P<0.01)(見表5、圖4)。

2.5 添加LY294002和過表達(dá)POSTN基因?qū)GC 803細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的影響 分別與正常的和過表達(dá)POSTN基因的MGC 803相比,添加LY294002會明顯地降低細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力(P<0.01)(見圖5、表6)。

2.6 添加LY294002和過表達(dá)POSTN基因?qū)GC 803細(xì)胞EMT的影響 Western blotting和RT-qPCR顯示,分別與正常的和過表達(dá)POSTN基因的MGC 803相比,添加LY294002會明顯地降低間質(zhì)標(biāo)志物(α-sma、VIM、snail和slug)的表達(dá),以及升高上皮標(biāo)志物E-Cadherin的表達(dá)(P<0.01)(見圖6、表7～9)。

表2 CCK8檢測調(diào)控POSTN基因?qū)GC 803細(xì)胞增殖的影響

表3 調(diào)控POSTN基因?qū)GC 803細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

表4 調(diào)控POSTN基因?qū)GC 803細(xì)胞侵襲的影響

表5 RT-qPCR檢測POSTN對MGC 803細(xì)胞EMT相關(guān)基因的影響

表6 CCK8檢測LY294002對MGC 803細(xì)胞調(diào)控POSTN基因后增殖的影響

表7 LY294002對MGC 803細(xì)胞的調(diào)控POSTN基因后轉(zhuǎn)移的影響

表8 LY294002對MGC 803細(xì)胞的調(diào)控POSTN基因后遷移的影響

表9 RT-qPCR檢測LY294002抑制POSTN激活MGC 803細(xì)胞的

3 討論

POSTN已被證實(shí)在各種轉(zhuǎn)移性腫瘤的癌癥基質(zhì)中上調(diào),例如肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌、食道鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌癌、頭頸癌、甲狀腺癌和前列腺癌[8]。POSTN被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞浸潤性、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性、血管生成、淋巴結(jié)血管生成、化療耐藥性和病人復(fù)發(fā)中均起著重要作用[9]。本研究進(jìn)行了POSTN和CD44共同免疫熒光染色,以檢測POSTN在胃癌轉(zhuǎn)移灶組織、原發(fā)灶組織及其鄰近正常組織中的表達(dá)。與鄰近的正常組織相比,POSTN在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶胃癌組織中的表達(dá)更高。對不同臨床階段胃癌病人的原發(fā)灶組織中的POSTN蛋白進(jìn)行了免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)晚期胃癌病人的原發(fā)灶組織中POSTN的蛋白表達(dá)水平明顯地高于早期。這些結(jié)果表明POSTN可能在胃癌的進(jìn)展中起重要作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證POSTN在胃癌發(fā)生中的作用,我們對MGC 803進(jìn)行過表達(dá)和敲除POSTN基因,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)POSTN基因可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖活性,以及促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲;并且敲除POSTN基因會降低胃癌細(xì)胞的增殖活性和減弱胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明POSTN促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,為胃癌提供了支持腫瘤生長以及促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。

EMT是指上皮細(xì)胞失去根尖-基底極性和細(xì)胞間質(zhì)黏附,轉(zhuǎn)化為具有侵襲性間充質(zhì)細(xì)胞的過程[10]。EMT在腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性中發(fā)揮著重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常細(xì)胞相比,過表達(dá)POSTN會促進(jìn)胃癌細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)和抑制上皮標(biāo)志物的表達(dá);以及敲除POSTN會抑制胃癌細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)和促進(jìn)上皮標(biāo)志物的表達(dá)。這些結(jié)果提示POSTN會促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT。然而POSTN如何影響EMT的,目前尚不清楚。另有研究[12]表明,AKT信號通路參與胃癌細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生和預(yù)后,我們發(fā)現(xiàn)AKT抑制劑LY2940002明顯緩解過表達(dá)POSTN導(dǎo)致的胃癌細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力,以及抑制胃癌細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)和促進(jìn)上皮標(biāo)志物的表達(dá)。這些結(jié)果表明POSTN可以經(jīng)AKT信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的EMT,進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。

綜上所述,POSTN不僅促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移,還加劇了癌癥的行為。最重要的是,POSTN的高表達(dá)與晚期胃癌有關(guān),POSTN的高表達(dá)水平是胃癌的危險因素之一。因此,POSTN可能是胃癌腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分化的預(yù)測因子。這表明POSTN是惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移的潛在治療靶標(biāo)。