低分子質(zhì)量肝素聯(lián)合順鉑對肝癌細(xì)胞自噬的影響

吳宣宣,張俊麗,商 玲,燕善軍,武文娟

盡管近年來肝癌的治療出現(xiàn)了新的靶向治療和免疫療法[1],但肝癌仍是全世界最普遍的致命性惡性腫瘤,其治療方法包括手術(shù)、經(jīng)動脈化學(xué)栓塞、化學(xué)藥物治療、放射療法以及肝移植等。病人確診時多為晚期,常用細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物治療如順鉑(cisplatin,DDP)?；瘜W(xué)治療已應(yīng)用多年,但易出現(xiàn)耐藥性仍是它的一個缺點(diǎn),所以聯(lián)合一些能提高化療敏感性的小分子物質(zhì)可能是一種有效的治療方案。低分子質(zhì)量肝素(low molecular weight heparin,LMWH)是相對分子質(zhì)量3 000～8 000的一組肝素片段,也是臨床上首選的抗凝藥[2],LMWH在其他方面也有不錯的作用:可抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成和轉(zhuǎn)移[3];可通過影響wnt信號通路抑制A2780卵巢癌細(xì)胞對DDP耐藥性的基因表達(dá),逆轉(zhuǎn)DDP的耐藥性[4]。細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化保守并可降解多余的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器的自殺方式。NASSOUR等[5]發(fā)現(xiàn)自噬通過促進(jìn)細(xì)胞死亡可有效阻止癌癥的發(fā)生。有研究[4]表明LMWH聯(lián)合化療藥物可增加自噬水平而導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡。本實(shí)驗(yàn)旨在探討LMWH與 DDP聯(lián)合作用對BEL-7404肝癌細(xì)胞自噬的影響及其分子機(jī)制,為肝癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌BEL-7404細(xì)胞株,由蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存,在有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中、37 ℃、5%CO2溫箱里培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國);CCK-8試劑盒(賽國公司);RIPR裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、三色預(yù)染蛋白marker(雅酶公司);MDC染色試劑盒 (北京索萊寶公司);RT-PCR試劑盒(Takara,日本);cDNA第一條鏈合成試劑盒(Thermo,美國);引物(南京金斯瑞公司);LC3、p62、Beclin1、AMPK、p-AMPK、ULK1、P-ULK1單克隆抗體(Affinity Biosciences,美國);β-actin單克隆抗體(愛博泰克公司);HRP標(biāo)記的二抗(sigma,美國);LMWH注射液(Alfa Wassermann,意大利);DDP(江蘇豪森藥業(yè))。

1.3 CCK-8法檢測BEL-7404細(xì)胞的存活率 將細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板,貼壁后分為對照組、空白組、LMWH組、DDP組及LMWH與DDP聯(lián)合組(L+D組)。DDP組藥物分別為0、1、2、4、8、16 μg/mL,LMWH組分別為50、100、200、400、800 IU/mL,L+D組為200 IU/mL LMWH與2 μg/mL DDP聯(lián)合,加藥48 h后以10 微升/孔的量加入CCK-8溶液,3 h后測吸光度并計算細(xì)胞存活率。

1.4 MDC染色法觀察BEL-7404細(xì)胞的自噬 BEL-7404細(xì)胞制成懸液后加藥處理并分為4組:對照組、LMWH組(LMWH質(zhì)量濃度為200 IU/mL)、DDP組(DDP質(zhì)量濃度為2 μg/mL)以及LMWH(200 IU/mL)與DDP(2 μg/mL)聯(lián)合的L+D組,培養(yǎng)48 h后吸去舊培養(yǎng)液,用1×Washing Buffer洗滌細(xì)胞2遍,然后每孔加入100 μL MDC工作液(以MDC stain:1×Washing Buffer=1∶9比例配制),37 ℃孵育15 min,棄去MDC染色液,再用1×Washing Buffer洗滌細(xì)胞3遍,在ZOE細(xì)胞成像儀中、200倍的視野下觀察并拍照,被染成綠色且有雙層膜結(jié)構(gòu)的是自噬小體,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 RT-PCR檢測自噬相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá) BEL-7404細(xì)胞制成懸液后按以上1.4中所述加藥處理分為4組,消化、離心后用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用RT-PCR擴(kuò)增各組LC3和p62的基因及管家基因β-actin。引物序列見表1。擴(kuò)增程序:95 ℃ 30 s預(yù)變性,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s循環(huán)40次擴(kuò)增。用2-△△CT法計算LC3和p62的相對表達(dá)量,并比較其差異。

1.6 Western blotting測自噬蛋白及通路蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板,按上述1.4的分組分為4組,藥物處理后收集、離心、洗滌細(xì)胞,加入適量RIPR裂解液,離心后用BCA法測吸光度。以50 μg為上樣質(zhì)量計算出蛋白樣本的上樣體積,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后將膜轉(zhuǎn)入一抗中4 ℃孵育過夜(β-actin的一抗1∶5 000稀釋,LC3、p62、Beclin1、AMPK、ULK1、p-AMPK和P-ULK1的一抗1∶1 000稀釋),次日取出膜用TBS-T共洗滌3次,每次10 min,再放入二抗中(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h左右,再洗膜3次,在ECL發(fā)光試劑中反應(yīng)1 min后放入BIO-RAD成像儀內(nèi)曝光、采集圖像,Image J軟件計算目的蛋白的相對表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析、Dunnet-t檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LMWH和DDP對肝癌BEL-7404細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示:經(jīng)DDP處理48 h后,隨DDP藥物濃度的增加對BEL-7404細(xì)胞的生存抑制作用越來越強(qiáng),即細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.01)(見表2),呈一定程度的濃度依賴性;而LMWH處理細(xì)胞48 h后,只有>200 IU/mL的LMWH才對肝癌細(xì)胞有抑制作用(P<0.01)(見表3);200 IU/mL LMWH與2 μg/mL DDP聯(lián)合時肝癌細(xì)胞存活率比兩藥單獨(dú)作用時更低(P<0.01)(見表4)。

表2 不同質(zhì)量濃度的DDP處理48 h后對肝癌細(xì)胞存活率的影響

表3 不同質(zhì)量濃度的LMWH處理48 h后對肝癌細(xì)胞存活率的影響

表4 LMWH與DDP單獨(dú)及聯(lián)合處理48 h后對肝癌細(xì)胞存活率的影響

2.2 LMWH和DDP對肝癌BEL-7404細(xì)胞自噬的影響 MDC是進(jìn)入細(xì)胞后的一種可濃聚于自噬體的染色劑,常被用于標(biāo)記自噬體。染色結(jié)果顯示:在對照組中,未做任何處理的BEL-7404肝癌細(xì)胞中也有少量的綠色點(diǎn)狀熒光結(jié)構(gòu),說明在正常情況下肝癌細(xì)胞也會發(fā)生少量的自噬;在加入200 IU/mL的LMWH處理48 h后,綠色點(diǎn)狀熒光結(jié)構(gòu)無明顯變化;而加入2 μg/mL的DDP處理48 h后,綠色點(diǎn)狀熒光結(jié)構(gòu)較對照組增多,表明DDP可以引起肝癌BEL-7404細(xì)胞發(fā)生自噬;當(dāng)LMWH和DDP聯(lián)合用藥48 h后,綠色熒光標(biāo)記的自噬小體與其他三組相比明顯增多,且亮度也增加(見圖1)。

2.3 LMWH和DDP對BEL-7404細(xì)胞自噬蛋白的mRNA表達(dá)的影響 細(xì)胞分組處理后檢測LC3和p62的mRNA表達(dá),RT-PCR結(jié)果顯示:LMWH組和DDP組LC3的mRNA表達(dá)較對照組升高(P<0.01),p62較對照組降低(P<0.05);與DDP組和LMWH組比較,L+D組LC3的mRNA表達(dá)升高(P<0.01),p62的表達(dá)降低(P<0.05);而L+D組與對照組相比LC3的mRNA表達(dá)升高和p62表達(dá)降低的變化更明顯(P<0.01)(見表5)。

2.4 LMWH和DDP對BEL-7404細(xì)胞的自噬蛋白表達(dá)的影響 加藥處理48 h后肝癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量顯示:LMWH組和DDP組與對照組比較上調(diào)了LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)(P<0.05和P<0.01),下調(diào)p62的表達(dá)(P<0.01);L+D組的LC3Ⅱ的表達(dá)與DDP組、LMWH組相比明顯升高(P<0.01),p62明顯降低(P<0.01和P<0.05),但與對照組相比,LC3Ⅱ的表達(dá)升高、p62降低的變化比單獨(dú)用藥更明顯(P<0.01)(見圖2、表6)。

2.5 LMWH和DDP對BEL-7404細(xì)胞的通路蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)藥物作用48 h后,肝癌細(xì)胞通路蛋白的表達(dá)顯示:LMWH組與對照組中AMPK-ULK1-Beclin1通路中的AMPK和ULK1的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但DDP組與L+D組的表達(dá)均高于對照組(P<0.05～P<0.01);Beclin1表達(dá)量方面,除LMWH組與DDP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外,其他組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01),而L+D組的表達(dá)均高于其他3組(見圖3、表7)。

表5 LMWH與DDP單獨(dú)及聯(lián)合處理肝癌細(xì)胞48 h后自噬蛋白mRNA的表達(dá)情況

表6 LMWH與DDP單獨(dú)及聯(lián)合處理48 h后自噬蛋白的表達(dá)情況

3 討論

雖然有研究[6]表明:高爾基蛋白73、鐵蛋白及甲胎蛋白三種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測比單獨(dú)檢測增加了肝癌的診斷敏感性。但肝癌仍有早期難發(fā)現(xiàn)、進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移范圍廣且預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn),目前在全球范圍內(nèi)死亡病例數(shù)排名第二,且發(fā)病率逐年增加[7],所以急需找到新的治療思路。DDP是第一個單用或與化療藥物聯(lián)合使用的一線化療藥物,被用于多種實(shí)體腫瘤的化療如卵巢癌[8]、胃癌[9]、肺癌[10]、肝癌[11]等。DDP的作用主要是破壞DNA結(jié)構(gòu),在損傷無法修復(fù)的地方引發(fā)細(xì)胞凋亡,它的作用與劑量有關(guān),但大劑量又會出現(xiàn)嚴(yán)重的不良作用及耐藥性,后者也是病人長期化療中不可避免的現(xiàn)象。LMWH通過影響癌細(xì)胞黏附、增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成[12]直接影響腫瘤的生物學(xué)作用已被廣泛接受,而這些特性為其與抗腫瘤療法的聯(lián)合提供了基礎(chǔ),常見的聯(lián)合方法有:聯(lián)合其他抗腫瘤血管生成藥物通過多種途徑改變腫瘤微環(huán)境,以及聯(lián)合化療藥物增強(qiáng)對腫瘤的殺傷作用,如LMWH聯(lián)合DDP可以拮抗卵巢癌的化療耐藥性[4],達(dá)肝素鈉對體外培養(yǎng)的人A549 肺癌細(xì)胞和其異種移植模型均有生長抑制作用,與DDP合用可增強(qiáng)其抑制作用[13]等。因?yàn)楦嗡劓溕嫌辛蛩猁}和羧基,所以帶正電荷的藥物如吲哚美辛、水順鉑[14],可以與這些帶負(fù)電荷的基團(tuán)相互作用,TONG等[14]研究表明:普朗尼克與肝素在合適溫度下偶聯(lián)形成納米復(fù)合物,它顯著增強(qiáng)了其載藥能力。綜上,LMWH聯(lián)合DDP可能成為一種增強(qiáng)DDP作用的聯(lián)合治療癌癥的方法。本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8法檢測到200 IU/mL的LMWH和2 μg/mL的DDP單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥48 h后BEL-7404細(xì)胞的存活率分別為(90.47±2.53)%、(72.25±5.84)%、(38.33±3.65)%,結(jié)果顯示,相比于單獨(dú)用藥來說,聯(lián)合用藥降低細(xì)胞存活率的作用更明顯,表明LMWH可以提高DDP對肝癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。

自噬是一種進(jìn)化保守并可降解多余的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器的自殺方式。自噬在腫瘤中有雙重性作用:既可通過剝奪細(xì)胞的營養(yǎng)阻止腫瘤的發(fā)生,也可通過賦予代謝優(yōu)勢[15]促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。Beclin1與液泡分選蛋白34(vacuole separation of proteins 34,VPS34)共同組成Beclin1-VPS34復(fù)合物,參與自噬體的成核。而自噬體擴(kuò)張需要LC3Ⅰ先脂化成LC3Ⅱ被招募到自噬小體膜中,然后結(jié)合到p62上再與溶酶體融合后一起被降解[16]。因此,本研究通過檢測LC3Ⅱ和p62蛋白的相對表達(dá)量來評估自噬的發(fā)生程度。為了探討LMWH聯(lián)合DDP能否誘發(fā)自噬提高肝癌細(xì)胞對DDP的敏感性,用MDC染色法表明聯(lián)合用藥可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞明顯發(fā)生自噬,比單藥作用效果更明顯;Western blotting結(jié)果顯示:DDP作用后明顯提高了LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)、降低了p62的表達(dá),表明單獨(dú)使用DDP時對肝癌細(xì)胞生長有抑制作用,但此時自噬可能在慢慢增強(qiáng),肝癌細(xì)胞逐漸產(chǎn)生耐藥,而聯(lián)合LMWH使用時蛋白LC3Ⅱ的相對表達(dá)量較DDP組顯著升高、p62的表達(dá)顯著降低;RT-PCR檢測它們mRNA的表達(dá)結(jié)果與Western blotting和MDC染色結(jié)果一致,均提示LMWH與DDP聯(lián)合作用有效增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的自噬。

表7 LMWH和DDP單獨(dú)及聯(lián)合處理48 h后通路蛋白的表達(dá)情況

眾所周知,AMPK-ULK1-Beclin1信號通路是目前調(diào)控自噬的重要途徑之一,其中AMPK與自噬密切相關(guān),高分解代謝或應(yīng)激條件下可能導(dǎo)致氨基酸不足和AMP/ATP比例失調(diào),最終激活A(yù)MPK[17],激活的AMPK為P-AMPK可能有助于線粒體自噬系統(tǒng)的激活[18]:它通過直接磷酸化ULK1調(diào)節(jié)自噬的啟動,Beclin1是UlK1在氨基酸脫羧條件下的另一個靶點(diǎn),所以P-AMPK可以激活Beclin1進(jìn)而激活自噬前VPS34復(fù)合物最終啟動自噬[19]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)[20-22]表明AMPK-ULK1依賴性自噬參與多種疾病的調(diào)控和轉(zhuǎn)化,但鮮見作用在肝癌中的報道。為了探索LMWH聯(lián)合DDP激活自噬的途徑是否通過AMPK-ULK1-Beclin1通路,我們檢測到通路蛋白AMPK和ULK1的表達(dá)幾乎無變化,卻促進(jìn)了AMPK和ULK1磷酸化,L+D組的P-AMPK/AMPK、P-ULK1/ULK1及Beclin1的蛋白表達(dá)較其他3組明顯升高,即聯(lián)合用藥激活了AMPK-ULK1-Beclin1信號通路。基于這些數(shù)據(jù),我們可以認(rèn)為LMWH聯(lián)合DDP誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增強(qiáng)自噬可能是通過激活A(yù)MPK-ULK1-Beclin1信號通路實(shí)現(xiàn)的。

我們之前的研究表明:高濃度的LMWH可抑制肝癌細(xì)胞的增殖[23]、LMWH聯(lián)合DDP可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[24]。而在本研究中,我們進(jìn)一步闡明了LMWH聯(lián)合DDP降低了肝癌BEL-7404細(xì)胞存活率、明顯增強(qiáng)肝癌細(xì)胞自噬,可能是通過激活A(yù)MPK-ULK1-Beclin1信號通路實(shí)現(xiàn)的,證明了LMWH聯(lián)合DDP可增強(qiáng)DDP的抗腫瘤活性。因此,我們認(rèn)為LMWH與DDP聯(lián)合用藥可為肝癌的治療提供新思路。