安徽某三級醫(yī)院金黃色葡萄球菌的分子流行病學

張慧敏 曹嘉欣 何知恩 趙杭 孫寶林

收稿日期：2022-11-24

基金項目：國家自然科學基金項目（32070132）。

作者簡介：張慧敏，碩士研究生，主要從事病原微生物毒力與耐藥研究。

*通訊作者：孫寶林，教授，主要從事病原微生物毒力與耐藥研究。

摘要：目的 為研究安徽省金黃色葡萄球菌的流行病學特征，收集了安徽某三級醫(yī)院100株臨床金黃色葡萄球菌，以期為預防和治療金黃色葡萄球菌感染提供理論依據(jù)。方法 2021年9月—12月期間，收集來自安徽某三級醫(yī)院不同患者臨床產生的100株金黃色葡萄球菌分離株，通過Vitek2 Compact System 3鑒定分離株，并用多位點序列分型（MLST）進行分子分型。結果 本研究對100株金黃色葡萄球菌分離株做了17種抗生素的藥敏實驗，結果顯示對青霉素的耐藥率最高，高達93%。統(tǒng)計學分析法證明大部分對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）比甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）的耐藥率高；并發(fā)現(xiàn)28個ST型，ST59、ST6697分型數(shù)量分布最多，CC5檢出率均高于其他克隆群。結論 安徽某三級醫(yī)院的金黃色葡萄球菌分離株具有獨特的分子特征和抗生素耐藥性特征，抗生素耐藥性特征可能與當?shù)乜股厥褂泌厔萦嘘P。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；流行病學分析；多位點序列分型；MLST分型；MRSA

中圖分類號：R978.1? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）06-0417-07

Molecular Epidemiology of Staphylococcus aureus in a

Tertiary Care Hospital in Anhui

Zhang Hui-min1，2，? ?Cao Jia-xin1，2，? ?He Zhi-en2，3，? ?Zhao Hang1，2，? ?Sun Bao-lin1，2

（1 Mudanjiang Normal University，? ?Mudanjiang? ?157011;

2 Life Sciences and Medicine， University of Science and Technology of China，? ?Hefei? ?230022;

3 The First Hospital of the University of Science and Technology of China，? ?Hefei? ?230002）

Abstract： Objective To develop a theoretical framework for the prevention and treatment of S. aureus， 100 clinical S. aureus isolates from the tertiary care hospital in Anhui were gathered to examine the epidemiological characteristics of the disease in Anhui Province. Methods 100 clinical S. aureus isolates from patients in tertiary care hospital in Anhui were gathered between September 2021 and November 2021. By using the VITEK2 Compact System 3， the isolates were recognized， and their genotypes were molecularly typed using multi-locus sequence typing （MLST）. Results In this study， 17 antibiotic sensitivity tests were done on 100 S. aureus isolates， of which the highest resistance rate to penicillin was 93%. Statistical analysis was used to prove that most MRSA had a higher resistance rate than MSSA; and 28 ST types were found， with the largest distribution of ST59 and ST6697 typing numbers， and all CC5 detection rates were higher than other clonal groups. Conclusion Staphylococcus aureus isolates from a tertiary care hospital in Anhui have unique molecular and antibiotic resistance characteristics， and the antibiotic resistance characteristics may be related to local antibiotic use trends.

Key words： Staphylococcus aureus;? ?epidemiological analysis;? ?multilocus sequence typing;? ?MLST typing;

MRSA

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種易引發(fā)臨床感染的革蘭陽性菌，主要定植在人類皮膚和黏膜表面。患者通常會在社區(qū)和醫(yī)療保健環(huán)境中受到金黃色葡萄球菌的感染[1-2]。金黃色葡萄球菌是社區(qū)獲得性感染（Community-acquired infections，CAI）和醫(yī)院獲得性感染（Hospital-acquired infections，HAI）的常見病原體之一[3]。臨床上，從青霉素開始到更多抗生素的出現(xiàn)，人類已經(jīng)和金黃色葡萄球菌斗爭多年[4]，但是金黃色葡萄球菌很快就對新型抗菌藥物產生了耐藥性，并且耐藥性發(fā)展迅速。其中，對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA）是最常見的多藥耐藥金黃色葡萄球菌，是醫(yī)療保健相關感染的主要病原菌之一，已被世界衛(wèi)生組織列為超級細菌[5]，成為臨床治療的一大難題[6]。

研究金黃色葡萄球菌流行病學，目的是揭示金黃色葡萄球菌克隆的起源、傳播和進化途徑，對于評估現(xiàn)有預防措施和規(guī)劃預防措施至關重要。研究金黃色葡萄球菌流行病學的技術有很多，包括多位點序列分型（MLST），葡萄球菌蛋白A（spa）分型，葡萄球菌盒染色體mec（SCCmec）分型，輔助基因調節(jié)劑（agr）分型和毒素基因譜分析[7]。

目前，常見的分子分型方法是MLST，通過MLST已經(jīng)鑒定出幾種克隆復合物，主要有CC5、CC8和CC80，不同地區(qū)的流行病學差異比較大，在北美，ST5、ST8、ST36和ST45是最常見的分型[8]；歐洲，ST5、ST8和ST22是最常見的分型[9]；亞洲，ST5和ST239一直是亞洲醫(yī)院中兩種主要的金黃色葡萄球菌克隆[10]。

隨著時間的推移，國內金黃色葡萄球菌流行的基因型已經(jīng)發(fā)生改變，2012年ST239和ST7是最常見的基因型[11]；從2013年—2016年，我國最流行的基因型是ST59和ST239[12]，然而2018年，我國流行的金黃色葡萄球菌分型是ST5和ST188[13]。鑒于流行病學的變化，及時更新當?shù)睾彤惖亟瘘S色葡萄球菌流行性的信息對于預防和控制這種病原體至關重要[14]。為了進一步探究安徽省金黃色葡萄球菌的流行病學特征，本研究以安徽某三級醫(yī)院2021年檢出的100株金黃色葡萄球菌為研究對象，進行基因組流行病學與耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集 2021年9月—12月安徽省合肥市安徽某三級醫(yī)院分離的各類臨床標本中的金黃色葡萄球菌菌株100株，接種在血瓊脂板上并在37 ℃下培養(yǎng)以分離細菌克隆。Vitek2 Compact System 3用于藥敏實驗，鑒定陽性菌株。

1.2 實驗材料和試劑

1.2.1 試劑

實驗培養(yǎng)基：TSB培養(yǎng)基，1 L ddH2O中加入30 g TSB 粉末。

分子克隆相關的酶：2× Rapid Taq Master Mi × （Vazyme） 用于PCR檢測?；蚪M提取試劑盒（StarPrep Plasmid Miniprep Kit）、中和緩沖液苯酚、氯仿、異戊醇（生工公司）。

1.2.2 儀器

超凈工作臺（上海智誠分析儀器制造公司）、搖床（上海智誠分析儀器制造公司）、普通PCR儀（Thermo）、離心機（Beckman）等。

1.3 提金黃色葡萄球菌的基因組

提前搖好的菌液放在離心管中，12 000 r/min，離心2 min，倒掉上清，收集菌體。用溶葡球菌酶（2×LSA）重懸菌體，放置37 ℃，220 r/min的搖床進行消化。消化后放置離心機，重復上述步驟，取細胞懸浮液繼續(xù)重懸菌體，重懸后加細胞裂解液，上下顛倒；再去通風櫥處加500 μL苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），劇烈搖晃，12 000 r/min，離心10 min， 吸上清至吸附柱中，靜置3 min，12 000 r/min，離心3 min。倒掉吸附柱中廢液，向收集管中加入500 μL WB漂洗液（Wash BufferFor Western Blot），12 000 r/min，離心1 min，漂洗兩次，漂洗后空，12 000 r/min，離心5 min，將吸附柱套在1.5 mL的EP管中，加入100 μL提前預熱好的無菌ddH2O，靜置后，12 000 r/min，離心1 min。在－4 ℃或者－20 ℃環(huán)境下保存。

1.4 目標DNA片段的擴增

對金黃色葡萄球菌進行MLST分型，一共需要7個管家基因arcC、aroE、glpf、gmk、pta、tpi、yqil，在PubMLST（https：//pubmlst.org/organisms/staphylococcus-aureus/primers）中找到7個相應的測序引物，結合相應PCR聚合酶說明書要求進行體系配置。100株菌均提取DNA，提取DNA后進行目的DNA片段擴增；擴增后的未純化的DNA片段，送測序公司正向測序，測序片段的長度在300～800 bp之間。

1.5 分子分型

測序結果需在SanpGene中分析，在MLST數(shù)據(jù)庫（http：//saureus.mlst.net）中將序列與相應等位基因譜的序列進行比較，從而確定序列類型，并用Search by locus combinations（https：//pubmlst.org/bigsdb？db=pubmlst）確定ST類型及克隆群。確定分型后，應用Phyloviz online 網(wǎng)站（http：//online.phyloviz.net/index）建立系統(tǒng)發(fā)育樹，更直觀地看到種群結構圖。

1.6 統(tǒng)計學統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析，使用SPSS Statistics 26.0執(zhí)行的。卡方檢驗用于比較不同樣本來源之間甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）和MRSA的數(shù)量，MSSA和MRSA分離株之間的耐藥率以及性別、年齡與克隆復合物之間的關系。P<0.05表明存在統(tǒng)計學上顯著差異。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌樣本來源

2021年9月—12月從安徽某三級醫(yī)院隨機收集金黃色葡萄球菌100株，其中樣本來源于新鮮血液、深部痰液、膿性分泌物、引流液、其他標本、各種穿刺液、尿液。金黃色葡萄球菌的主要標本來源是深部痰液和膿性分泌物，見表1。MRSA與MSSA的標本來源分析比較，除了引流液以外無統(tǒng)計學意義P＞0.05。

2.2 金黃色葡萄球菌耐藥情況

本研究對100株金黃色葡萄球菌分離株做了17種抗菌藥物的藥敏實驗，所有MRSA分離株均對苯唑西林和青霉素耐藥。一般而言，MRSA菌株對測試抗菌藥物的耐藥率遠高于MSSA菌株；本研究中除環(huán)丙沙星、復方磺胺甲惡唑和四環(huán)素耐藥率差異無統(tǒng)計學意義外，其他耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 金黃色葡萄球菌MLST分型

在100株臨床金黃色葡萄球菌中有ST1：5株；ST5：6株；ST6：3株；ST7：5株；ST59：11株；ST15：4株；ST22：4株；ST25：4株；ST59：11株；ST72：2株；ST88：2株；ST121：1株；ST188：3株；ST239：3株；ST338：1株；ST537：1株；ST630：4株；ST764：2株；ST789：1株；ST950：1株；ST1281：1株；ST3074：1株；ST3821：1株；ST4894：1株ST5468：1株；ST6697：15株；ST6763：1株；ST7063：1株；ST7397：1株；NA14株。金黃色葡萄球菌分離株在基于MLST的7個管家基因位點中的5個或更多具有同一性，被稱為克隆復合體（CC）。見表3，ST1和ST5的位點差異最大，因此沒有緊密相關。ST5和ST6僅在兩個位點上彼此不同，因此，ST5和ST6密切相關。

100株金黃色葡萄球菌有11種克隆復合體，多位點序列分型詳見表4。

圖1系統(tǒng)發(fā)育樹為ST分型之間的關系，該圖說明了極其多樣化的金黃色葡萄球菌種群結構，同種克隆復合物的金黃色葡萄球菌的ST分型位點靠得更近。

2.4 MRSA與MSSA克隆復合物的比較

克隆復合體CC1：MSSA 7株，MRSA 1株；CC5：MSSA 9株，MRSA 10株；CC7：MSSA 6株；CC8：MSSA 3株；MRSA 9株；CC15：MSSA 5株；CC20：MSSA 1株；CC22：MSSA 2 株，MRSA 2株；CC59：MSSA 1株，MRSA 12株；CC88：MSSA 1株，MRSA 1株；CC121：MSSA 1株；CC181：MSSA 8株，MRSA 7株。其中克隆復合體CC5的MRSA株最多，見圖2。

2.5 克隆復合物類型與年齡和性別無關

本研究中男性患者70人、女性患者30人，老年人感染金黃色葡萄球菌的居多，影響感染的因素有很多。為了分析不同的CC克隆復合物與患者的性別與年齡的相關性。將常見的CC克隆復合物（CC1、CC5、CC7、CC8、CC15、CC22、CC59、CC181）與性別、年齡兩因素相關聯(lián)。發(fā)現(xiàn)CC5克隆復合物與性別、年齡兩因素有相關性，患者年齡越大感染CC1、CC59的可能性越大（P<0.005），但是與性別無關；雖然存在克隆復合物與兩因素相關聯(lián)的可能性，但是調查的患者人數(shù)有限，不能說明不同種類的克隆復合物與年齡、性別呈相關性。見表5。

2.6 金黃色葡萄球菌來源的科室

100株金黃色葡萄球菌主要來自重癥醫(yī)學科、兒童危重癥科、血管外科、關節(jié)外科、皮膚科、老年呼吸內科、急診醫(yī)學科、口腔頜面外科、創(chuàng)傷骨科、普通外科、綜合老年醫(yī)學科、綜合兒科、老年內分泌科、小兒外科神經(jīng)外科、腎內科、其他科、耳科、兒童呼吸科、燒傷整形外科、綜合腫瘤放療科、心臟大血管外科、肝臟外科、彌漫性結締組織病科以及綜合泌尿外科，其中重癥醫(yī)學科（Department of critical care medicine）金黃色葡萄球菌的數(shù)量最多，有NA 2 株、ST5CC5 1株、ST6CC5 1株、ST7CC7 2株、ST25CC5 1株、ST59CC59 1株、ST239CC8 1株、ST764CC5 1株、ST6697CC184 1株、ST7063CC7 1株、ST7397CC5 1株；而肝臟外科（Liver surgery）有ST59CC59 1株；彌漫性結締組織病科（Diffuse connective tissue disease）有ST88CC88 1株；以及綜合泌尿外科（General urology）有ST59CC59 1株，這三個科室只有一種ST 型，見圖3。

3 討論

目前，金黃色葡萄球菌是醫(yī)院內常見的機會病原體，大部分健康人群都會攜帶金黃色葡萄球菌，不表現(xiàn)臨床癥狀，但當宿主免疫力低下，金黃色葡萄球菌則會引發(fā)感染性疾病[15-16]。本研究在所采集的臨床樣本中，深部痰液樣本占據(jù)37%，推測金黃色葡萄球菌在醫(yī)院主要引起呼吸道感染，因而要注意呼吸科室的感染預防。

通過對感染金黃色葡萄球菌患者年齡及性別調查發(fā)現(xiàn)，男性老年患者感染金黃色葡萄球菌的數(shù)量最多，可能與老年患者有其他患病史及身體抵抗力低下等有關。醫(yī)院不同科室感染情況不同；為了方便醫(yī)生制定有效的治療方案，有必要確定不同科室的金黃色葡萄球菌感染情況。根據(jù)從醫(yī)院科室收集的數(shù)據(jù)，本課題發(fā)現(xiàn)在重癥醫(yī)學科金黃色葡萄球菌的檢出率最高。這可能是由于這個科室的大多數(shù)患者病情嚴重，身體免疫力低下，容易感染金黃色葡萄球菌，因此需要有效的治療。

據(jù)CHINET數(shù)據(jù)云（www.chinets.com）統(tǒng)計顯示：2021年，國內54家醫(yī)院收集的18398株MSSA對萬古霉素的耐藥率為0，7882株MRSA對萬古霉素的耐藥率為0[17-18]。與本次采集的100株臨床金黃色葡萄球菌對萬古霉素抗生素均無耐藥性，與文獻報道一致。通過本次研究數(shù)據(jù)并結合文獻分析[18]，萬古霉素對MRSA的效果與標準治療對MRSA的治療效果一樣，雖然有罕見的對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌，但是出現(xiàn)的概率很小，說明萬古霉素依然是治療耐藥性金黃色葡萄球菌的特效藥。

數(shù)據(jù)云監(jiān)測（CHINET）數(shù)據(jù)顯示：從2011年—2021年，中國MRSA分離株的檢出率逐年下降，從50.6%下降到30.0%。與這些數(shù)據(jù)相比，本研究中100株金黃色葡萄球菌對苯唑西林的耐藥率為47%，約與2011年報告的比率相近，比2021年報告的比率高。從地域角度分析，沈陽、廣州、江蘇等城市的金黃色葡萄球菌臨床分離株的MRSA檢出率與本研究的MRSA檢出率相近，但是其他地區(qū)的MRSA檢出率與本研究存在差異性，造成差異的原因可能和當?shù)氐目股厥褂糜嘘P。

微生物分型通常用于確定感染的來源和途徑、確認或排除疫情爆發(fā)、追蹤醫(yī)療相關病原體的交叉?zhèn)鞑?、識別毒株和評估控制措施的有效性[19-20]。MLST已成為流行病學調查的主要工具，因為它具有鑒別力，易于應用和分析結果，且已有較為全面的數(shù)據(jù)庫，可以輕松訪問所有現(xiàn)有的遺傳圖譜并進行比較[21-22]。這種工具在臨床環(huán)境中具有優(yōu)勢，尤其是在微生物感染的診斷方面[23-24]。目前，據(jù)CHINET云統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：2021年，30 1917株菌株中，金黃色葡萄球菌占8.93%，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，位列第三位。由于菌株的多樣性和臨床醫(yī)療的影響，MLST數(shù)據(jù)庫中金黃色葡萄球菌的ST型數(shù)量還在增加，目前可確定的有ST有4 800個，此次研究的100株臨床分離株中發(fā)現(xiàn)有28個ST型，10個克隆群（CC），其中ST59和ST6697的數(shù)量占據(jù)前兩位，克隆復合體CC5的數(shù)量最多。研究顯示：55歲以上老年人主要感染的金黃色葡萄球菌分型類型是ST59，而幼兒、年輕人感染金黃色葡萄球菌ST6697最多，推測金黃色葡萄球菌ST59在安徽省老年人群體中傳播能力較強，金黃色葡萄球菌ST6697在安徽省幼兒與年輕人群體中傳播能力較強。另外本研究還統(tǒng)計了安徽某三級醫(yī)院科室分離的金黃色葡萄球菌的分型結果，其中重癥醫(yī)學科的金黃色葡萄球菌分型種類以及菌株的數(shù)量最多，推測主要原因是重癥患者的免疫力低下，容易感染金黃色葡萄球菌。

安徽某三級醫(yī)院金黃色葡萄球菌分離株具有獨特的分子特征和抗生素耐藥性特征，本研究僅對安徽某三級醫(yī)院的金黃色葡萄球菌進行分析，具有一些局限性。為此提出有效控制感染的策略，以期為臨床醫(yī)療做出貢獻。

參 考 文 獻

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