外泌體微RNA治療骨關(guān)節(jié)炎研究進(jìn)展

陸智豪，陳立民，王穎贊，曾 平

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院仙葫院區(qū)骨病創(chuàng)傷骨科，廣西 南寧 530023)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)病，其病理特征為進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨降解、滑膜炎癥和軟骨下骨硬化[1]。據(jù)估計(jì)，全球60歲以上的人口中，10.0%的男性和13.0%的女性罹患有癥狀的OA[2]。由于人口老齡化和社會(huì)工業(yè)化的進(jìn)程，OA的患病率進(jìn)一步增加，給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[3]。目前，臨床上對(duì)早期OA的治療多以緩解癥狀為主，主要應(yīng)用非甾體類藥物，但存在一定的不良反應(yīng)[4]。對(duì)于晚期OA患者則多采取手術(shù)治療，如關(guān)節(jié)置換術(shù)等，但手術(shù)治療要求手術(shù)醫(yī)師有較高的技術(shù)水平，患者需要承擔(dān)手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和昂貴的費(fèi)用，且不能對(duì)退變的關(guān)節(jié)及軟骨起修復(fù)作用。因此，尋求一種促進(jìn)軟骨再生修復(fù)和可逆轉(zhuǎn)早期OA關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)病變的關(guān)節(jié)內(nèi)治療方法是近來(lái)的研究熱點(diǎn)。目前，較為常用的關(guān)節(jié)內(nèi)治療方法是關(guān)節(jié)內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)[5]。然而，BMSCs療法存在注射部位壽命較短、異體移植的免疫激活、栓塞形成及不必要的或惡性轉(zhuǎn)化的可能，這給BMSCs療法帶來(lái)困難。外泌體是一種直徑為40～100 nm的脂質(zhì)雙分子層膜衍生囊泡，幾乎所有細(xì)胞都能分泌外泌體，且在體液中廣泛分布[6]，能以自分泌和旁分泌途徑參加細(xì)胞間通訊。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，外泌體中包含各種核酸，其中外泌體所包含的微RNA(microRNA，miRNA)通過(guò)與靶mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，從而調(diào)節(jié)多個(gè)生物化學(xué)途徑[7]。由于外泌體獨(dú)特的囊泡樣結(jié)構(gòu)，外泌體中的 miRNA能夠穩(wěn)定表達(dá)[8]。越來(lái)越多的研究表明，外泌體中的miRNA能有效地調(diào)控OA，其作用主要集中于對(duì)軟骨、滑膜及軟骨下骨的影響。因外泌體具有毒性小、安全性高、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在OA的治療中具有更好的臨床治療前景[9]。本文主要就外泌體miRNA對(duì)OA患者軟骨、滑膜、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及軟骨下骨的影響進(jìn)行綜述，以期為臨床和科研上應(yīng)用外泌體miRNA治療OA提供參考。

1 外泌體miRNA對(duì)軟骨的影響

與大多數(shù)組織不同，軟骨是無(wú)血管、淋巴和神經(jīng)的結(jié)締組織[10]，其再生潛力非常低，依靠軟骨自身修復(fù)不足以恢復(fù)退化組織的結(jié)構(gòu)和功能，因此，關(guān)節(jié)軟骨的再生及重塑也成為骨科醫(yī)生和研究人員亟需攻克的難題[11]。不同來(lái)源的細(xì)胞分泌的外泌體攜帶有不同特異性miRNA，對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡、自噬、焦亡、增殖具有調(diào)控作用。

1.1 外泌體miRNA對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用研究報(bào)道，外泌體miRNA可通過(guò)特異性調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)或抑制軟骨細(xì)胞凋亡[12]。正常的軟骨細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持健康狀態(tài)的一種自然的程序性細(xì)胞死亡，因此，軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡可加劇關(guān)節(jié)軟骨的降解，促進(jìn)OA的發(fā)展[13]。LIN等[14]研究證實(shí)，miR-140-5p富集于人牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSC)來(lái)源的外泌體，可在白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β處理的人軟骨細(xì)胞中促進(jìn)軟骨細(xì)胞凝聚糖、Ⅱ型膠原的α1鏈(type Ⅱ collagen α1，Col2α1)和SRY相關(guān)蛋白9(SRY-related high mobility group-box gene 9，Sox9)等相關(guān)mRNA的表達(dá)，顯著減少OA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理間充質(zhì)干細(xì)胞后衍生的外泌體能夠維持OA模型小鼠軟骨細(xì)胞的活力，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制是姜黃素通過(guò)抑制間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體miR-143和miR-124中的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，抑制其靶基因ROCK1和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥因子激活，從而間接抑制軟骨細(xì)胞凋亡[15-17]。研究報(bào)道，BMSCs衍生的外泌體能保護(hù)OA模型大鼠軟骨損傷[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs衍生的外泌體中最顯著富集的miRNA為miR-127-3p，其可抑制軟骨細(xì)胞中的CDH11，阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的激活，繼而減輕軟骨細(xì)胞損傷，減緩軟骨的降解[19]。

1.2 外泌體miRNA對(duì)軟骨細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用除了經(jīng)典的細(xì)胞凋亡方式外，細(xì)胞自噬、焦亡分別通過(guò)不同的形式調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，在OA的發(fā)展和治療中發(fā)揮作用。細(xì)胞焦亡是一種由炎癥小體觸發(fā)的促炎癥性程序性細(xì)胞死亡，與其他形式的程序性細(xì)胞死亡不同，焦亡與炎癥密切相關(guān)。研究表明，抑制軟骨細(xì)胞焦亡可改善軟骨變性和關(guān)節(jié)炎[20]。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)3可調(diào)節(jié)NF-κB基因活性[21]，而NF-κB基因的轉(zhuǎn)錄因子活性是激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體和焦變的關(guān)鍵因素。XU等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-326過(guò)表達(dá)可顯著抑制軟骨細(xì)胞中HDAC3和NF-κB p65的表達(dá)，促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、乙酰化STAT1和乙?；疦F-κB p65在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-326與HDAC3存在靶向關(guān)系；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)BMSCs來(lái)源的外泌體可將miR-326輸送到軟骨細(xì)胞和軟骨，并通過(guò)靶向HDAC3和STAT1/NF-κB p65抑制軟骨細(xì)胞焦亡，從而改善OA。

1.3 外泌體miRNA對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)控細(xì)胞自噬是在不致細(xì)胞死亡的情況下，通過(guò)分解功能紊亂的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)而使細(xì)胞得到翻新的一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制[23]。有研究表明，自噬在關(guān)節(jié)軟骨組織中發(fā)揮著雙重作用，細(xì)胞代謝加強(qiáng)和缺乏營(yíng)養(yǎng)都會(huì)增加自噬，從而提高細(xì)胞的應(yīng)激能力[24]，而自噬的過(guò)度激活可導(dǎo)致體外OA軟骨細(xì)胞的死亡[25]。WU等[26]通過(guò)體內(nèi)及體外研究證實(shí)，髕下脂肪墊來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可將miR-100-5p傳遞至軟骨細(xì)胞，而miR-100-5p特異性靶向哺乳動(dòng)物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin，mTOR)的非翻譯區(qū)域，并顯著增強(qiáng)軟骨細(xì)胞中的自噬水平，增強(qiáng)合成代謝，抑制IL-1處理的OA軟骨細(xì)胞的分解代謝。

1.4 外泌體miRNA對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的調(diào)控作用軟骨細(xì)胞是一種多功能細(xì)胞，能夠合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，起到修復(fù)損傷軟骨的作用。SUN等[27]研究發(fā)現(xiàn)，miR-320c在已分化為軟骨的人BMSCs來(lái)源外泌體中表達(dá)上調(diào)；來(lái)源于過(guò)表達(dá)miR-320c的人BMSCs來(lái)源外泌體可通過(guò)上調(diào)OA軟骨細(xì)胞中的SOX9，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖分化。在軟骨形成的早期階段，Wnt信號(hào)能激活軟骨細(xì)胞的增殖并抑制其分化[28]；Wnt家族成員5A(Wnt family member 5A，WNT5A)可激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，在OA的發(fā)病中對(duì)軟骨的破壞和降解起著關(guān)鍵作用[29]。MAO等[30]研究報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體miR-92a-3p直接靶向WNT5A，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移以及間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，防止早期軟骨損傷。有研究表明，滑膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體miR-140-5p通過(guò)激活Yes相關(guān)蛋白可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，且在前交叉韌帶橫斷OA大鼠模型中起到抑制關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重?fù)p傷和OA進(jìn)展的作用[31]。近年來(lái)，軟骨生成祖細(xì)胞(chondrogenic progenitor cells，CPCs)已被證實(shí)在OA患者治療中具有促進(jìn)軟骨修復(fù)、再生作用[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，MRL/MpJ超治愈小鼠CPCs來(lái)源外泌體中miR-221-3p在MRL/MpJ小鼠來(lái)源CPCs外泌體中高度富集，而MRL/MpJ小鼠來(lái)源CPCs外泌體中的miR-221-3p能夠通過(guò)與其相關(guān)通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖分化[33]。

2 外泌體miRNA對(duì)OA滑膜炎癥的治療作用

在OA患者中，滑膜的炎癥性改變統(tǒng)稱為滑膜炎，包括滑膜內(nèi)膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、新血管生成和纖維化。約70%的OA患者出現(xiàn)滑膜炎，其程度與疼痛和軟骨損傷相關(guān)[34]。急性滑膜炎被認(rèn)為是最早發(fā)生的關(guān)節(jié)改變之一，而外泌體對(duì)滑膜炎癥有一定的治療作用[35]。JIN等[36]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs衍生的外泌體向滑膜成纖維細(xì)胞提供miR-26a-5p，并通過(guò)控制環(huán)加氧酶2的表達(dá)減輕OA滑膜成纖維細(xì)胞的損傷；此外，關(guān)節(jié)內(nèi)注射過(guò)表達(dá)miR-26a-5p的BMSCs來(lái)源外泌體可通過(guò)減輕OA模型大鼠滑膜組織的炎癥和減少細(xì)胞凋亡來(lái)防止OA損傷。JIN等[37]研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSCs來(lái)源外泌體miR-9-5p的OA大鼠的關(guān)節(jié)軟骨組織呈連續(xù)、清晰的結(jié)構(gòu)，且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，OA癥狀減輕，其作用機(jī)制是來(lái)自BMSCs的外泌體miR-9-5p通過(guò)靶向逆轉(zhuǎn)原本在OA病變?cè)缙谶^(guò)表達(dá)的SDC1來(lái)抑制炎癥并減輕軟骨損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-100-5p在來(lái)源于人類脫乳牙髓干細(xì)胞外泌體(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED-Exos)中富集，SHED-Exos中miR-100-5p通過(guò)直接靶向下游mTOR的3′未翻譯區(qū)域，抑制軟骨細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8及MMP1、MMP3、MMP9、MMP13、人金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白基元5等金屬蛋白酶的表達(dá)，從而抑制顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[38]。

來(lái)自O(shè)A軟骨細(xì)胞的外泌體不僅可抑制滑膜炎癥，還可起到促炎作用。這些外泌體通過(guò)miR-449a-5p抑制自噬相關(guān)基因4B的表達(dá)，從而抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的自噬，促進(jìn)線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mitoROS)的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了炎癥小體的激活，最終加重滑膜炎癥，促進(jìn)OA的進(jìn)展，這為了解OA患者滑膜巨噬細(xì)胞和滑膜炎的激活提供了一個(gè)新的視角[39]。

3 外泌體miRNA對(duì)軟骨ECM的調(diào)控作用

關(guān)節(jié)軟骨ECM主要由蛋白多糖和Ⅱ型膠原組成，包括少量的軟骨細(xì)胞。ECM含有大量信號(hào)分子，其在調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、形態(tài)、遷移和代謝過(guò)程發(fā)揮積極作用，因此，當(dāng)ECM分解與合成失衡將導(dǎo)致OA的發(fā)生[40]。研究表明，外泌體能抑制MMP13的表達(dá)，可有效促進(jìn)OA大鼠軟骨細(xì)胞ECM修復(fù)，緩解關(guān)節(jié)疼痛[18]。

HDAC作為軟骨細(xì)胞成熟和骨骼生成的中心調(diào)節(jié)器，可抑制IL-1誘導(dǎo)的MMPs表達(dá)，調(diào)控軟骨ECM的降解[41]。MAO等[42]研究發(fā)現(xiàn)，OA患者軟骨分泌的外泌體中miR-95-5p表達(dá)顯著低于正常軟骨，而過(guò)表達(dá)的原代軟骨細(xì)胞外泌體miR-95-5p通過(guò)直接靶向HDAC，抑制OA模型MMPs的表達(dá)，從而抑制軟骨基質(zhì)的降解。SUN等[27]研究證明，BMSCs來(lái)源外泌體和BMSCs來(lái)源外泌體中過(guò)表達(dá)的miR-320c都能上調(diào)SOX9和下調(diào)OA軟骨細(xì)胞中MMP13的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞ECM降解，但過(guò)表達(dá)BMSCs來(lái)源外泌體中的miR-320c有更加顯著的抑制作用。

4 外泌體miRNA促進(jìn)OA軟骨下骨重塑

軟骨下骨皮質(zhì)骨改建增加是骨關(guān)節(jié)炎早期主要病理改變之一。軟骨下骨為淺層關(guān)節(jié)軟骨提供結(jié)構(gòu)支持和減震器，并在機(jī)械應(yīng)力的作用下，經(jīng)歷著改造和重塑的動(dòng)態(tài)平衡[43]。眾多學(xué)者研究探討了外泌體miRNA應(yīng)用于OA的治療前景，其中包括外泌體miRNA對(duì)OA軟骨下骨重塑的調(diào)節(jié)作用[44]。ZHOU等[45]使用miRNA芯片對(duì)OA患者和健康人的滑膜外泌體中miRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于滑膜外泌體的miR-126-3p在OA患者的滑液樣本中的表達(dá)較健康對(duì)照者顯著下調(diào)；體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)滑膜來(lái)源外泌體miR-126-3p能維持OA大鼠模型的軟骨下骨結(jié)構(gòu)，甚至逆轉(zhuǎn)OA動(dòng)物模型中鈣離子改變、關(guān)節(jié)空間形態(tài)和骨贅形成的改變，表明來(lái)源于滑膜外泌體的miR-126-3p對(duì)OA軟骨下骨重塑有促進(jìn)作用，能逆轉(zhuǎn)OA病理改變。

許多退行性骨關(guān)節(jié)疾病早期癥狀不明顯，出現(xiàn)癥狀時(shí)往往已經(jīng)到中晚期，這無(wú)疑加大了疾病的診治難度。研究證實(shí)，外泌體可作為多種疾病早期的生物標(biāo)志物，有助于疾病的早期診斷[46]。miR-210-5p在OA硬化性軟骨下骨成骨細(xì)胞(subchondral bone osteoblasts，SBOs)外泌體中富集,由于OA進(jìn)展過(guò)程中軟骨下骨的變化早于軟骨，SBOs來(lái)源的外泌體miR-210-5p的異常上調(diào)可作為OA的標(biāo)志物或預(yù)測(cè)因子。因此，抑制SBOs中miR-210-5p的表達(dá)可能是OA治療的一個(gè)新方向[47]。

5 總結(jié)與展望

隨著社會(huì)及人口老齡化趨勢(shì)的發(fā)展，OA以其高發(fā)病率、高致殘率引起醫(yī)學(xué)界的重視；但其具體的機(jī)制尚未明確，這對(duì)OA早期的診療帶來(lái)了難度。近年來(lái)，外泌體在臨床治療中的應(yīng)用日益發(fā)展，并在OA治療中顯示出巨大的潛力，尤其是不同來(lái)源的外泌體miRNAs通過(guò)緩解甚至逆轉(zhuǎn)OA的病理改變，如抑制軟骨的降解和滑膜炎癥及促進(jìn)軟骨下骨重塑，對(duì)OA起到顯著的治療作用。外泌體中所包含的不同的RNA和蛋白質(zhì)成分，可作為OA早期癥狀不明顯時(shí)的診斷生物標(biāo)志物，亦可作為治療OA的藥物載體。然而，不同來(lái)源的外泌體miRNA在OA的生理病理中的關(guān)聯(lián)仍需更多研究，以便開(kāi)辟一個(gè)與OA治療策略相關(guān)的創(chuàng)新研究領(lǐng)域。