乳粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）能力驗(yàn)證PCR技術(shù)的探索

仇平平　田夢(mèng)　孫巧巧

摘 要：為提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的能力，本文依據(jù)NIFDC-PT-384乳粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書(shū)、GB 4789.40-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn) 》，探索傳統(tǒng)生化方法和PCR技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的方法。結(jié)果表明，樣品CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），樣品CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），結(jié)果均為滿意。本實(shí)驗(yàn)室具備檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的能力，PCR技術(shù)很好地印證了傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：乳粉，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），能力驗(yàn)證，PCR技術(shù)

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.16.028

0 引言

克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）是腸桿菌科內(nèi)一類短桿狀革蘭氏陰性菌，1980 年以前被稱為“產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌（yellow-pig mented Enterobacter cloacae）”，1980 年更名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），2008年被重新定義為一個(gè)新屬，即克羅諾桿菌屬[1-2]。國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB4789.40-2016也做了相應(yīng)調(diào)整，由“阪崎腸桿菌”更名為“克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）”。阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種條件致病菌，主要傳播媒介是奶粉，6月齡以下嬰兒是克羅諾桿菌屬的易感人群。嬰兒感染該菌后會(huì)引起菌血癥、腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎等，致死率高達(dá)40%-80%[3-5]。針對(duì)嬰幼兒食品的安全要求，國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 29921-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》中明確規(guī)定，嬰兒（0～6月齡）配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）不得檢出。

近些年，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的檢測(cè)技術(shù)也在快速發(fā)展，其中以PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)展最快[ 7- 8 ]。目前，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）的檢測(cè)主要是以傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法為主，如何將PCR技術(shù)和傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法結(jié)合起來(lái)應(yīng)用到日常工作中是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)的出發(fā)點(diǎn)。參照SN/T 1632.2-2013《出口奶粉中克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)方法 第2部分：PCR方法》合成阪崎腸桿菌特異性引物SAFA-F、SAFA-R，參照《中國(guó)藥典》2020年版四部1021合成16SrRNA通用引物16SV1F、16SV3R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，查看凝膠電泳結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送至第三方機(jī)構(gòu)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)尋找同源微生物，與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法結(jié)果比較，以期可以將PCR技術(shù)和傳統(tǒng)生化培養(yǎng)方法有效結(jié)合起來(lái)，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

1 材料

1.1 樣品

樣品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，2份待測(cè)樣品，每份樣品包含裝有菌球的西林瓶1瓶和相同編碼的乳粉1袋（規(guī)格：100克/袋），2份樣品分別編號(hào)為：CODE12和CODE19。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（mLST）基礎(chǔ)及配套添加試劑萬(wàn)古霉素、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI瓊脂）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）干制生化鑒定試劑盒、氧化酶試紙及試劑、DNA提取裂解液，以上均采購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

引物SAFA-F：GGGTTGTCTGCGAA GCGAA，SAFA-R：GTCTTGTGCTG CGAGTTTG；引物16SV1F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物16SV3R：GTATTACCGCGGCTGCTGGC（均由金唯智生物科技有限公司合成）。Premix Taq（TaKaRaTaqTM Version 2.0 plus dye）（品牌：TaKaRa），DL1000 DNA Marker（品牌：TaKaRa），瓊脂糖（品牌：IOWESTR），5×TBE緩沖液（品牌：SolarbioR），GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色劑（品牌：BIOTIUM）。

1.3 儀器設(shè)備

無(wú)菌均質(zhì)器（上海德記行科技發(fā)展公司）、DHP-9162B電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器）、SPL -2 50生化培養(yǎng)箱（天津市萊波特瑞儀器）、VITEK2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（梅里埃）、H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器）、SVCJ-2G型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備）、T100定性PCR儀（品牌：伯樂(lè)BIO-RAD）、Powerpac Universa l通用電泳儀（品牌：伯樂(lè)BIO-RAD）、GelDoc EZ凝膠成像分析系統(tǒng)（品牌：伯樂(lè)BIORAD）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株

阪崎腸桿菌 ATCC29544。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)樣品菌球的西林瓶，將西林瓶?jī)?nèi)的小球加入到盛有900 mL滅菌緩沖蛋白胨水（BPW）的無(wú)菌均質(zhì)袋中，充分溶解。然后再將與西林瓶相同編碼的乳粉樣品加入到上述緩沖蛋白胨水（BPW）中，充分混勻，作為樣品勻液。以阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽(yáng)性對(duì)照。

2.2 前增菌、增菌和PCR實(shí)驗(yàn)

2.2.1 前增菌

將上述樣品勻液置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)18 h。

2.2.2 增菌

移取上述培養(yǎng)物1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素（mLST-Vm）肉湯中，混勻，44 ℃培養(yǎng)24 h。

2.2.3 菌液提取DNA模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)

（1）菌液提取DNA。取前增菌液1 mL于1.5 mL離心管中，3000×g離心10 min，棄去上清，加入200 μL裂解液，渦旋混勻，沸水浴裂解10 min，冷卻后12000×g離心2 min，取上清即為模板。

（2）特異性引物PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye） 25 μL，DNA模板2 μL，引物SAKA-F和引物SAKA-R（10 μmol/L）各1 μL，加無(wú)菌無(wú)酶水至總體積50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

（3）凝膠電泳。用電泳緩沖液1×TA E制備1%瓊脂糖凝膠（冷卻至50 ℃左右加入GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色劑），取PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，用DL1000DNA Marker做參照。3 V/cm～5 V/cm恒壓電泳，電泳30 min～60 min，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

（4）測(cè)序。將擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

2.3 分離

上述mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，輕搖混勻，用接種環(huán)取1環(huán)，劃線接種于阪崎顯色培養(yǎng)基平板上，平行劃線接種兩個(gè)平板，36 ℃，培養(yǎng)24 h。

挑取5個(gè)可疑菌落，劃線接種于TSA平板上，25 ℃，培養(yǎng)48 h。

2.4 鑒定

挑取TSA平板上黃色可疑菌落，選用商品化的生化鑒定試劑和梅里埃VIKE2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)上機(jī)鑒定進(jìn)行生化鑒定。

菌落提取DNA模板：用接種環(huán)取一環(huán)純化后的菌落，溶于200 μL裂解液中，渦旋混勻，沸水浴裂解10 min，冷卻后12000×g離心2 min，取上清即為模板。

16?S通用引物PCR 擴(kuò)增：反應(yīng)體系Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）25 μL，DNA模板2 μL，引物16S1VF和引物16SV3R（10μmol/L）各1 μL，加無(wú)酶無(wú)菌水至總體積50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。凝膠電泳和測(cè)序同2.2.3。

3 結(jié)果與分析

3.1 生化鑒定結(jié)果

采用商品化生化鑒定試劑盒和梅里埃VIKE2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，本次能力驗(yàn)證CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），與中檢院的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致，結(jié)果滿意。

在阪崎腸桿菌顯色平板上，克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）呈現(xiàn)藍(lán)-綠色，如圖1（a）、（b）、（c）所示，CODE12為無(wú)色菌落，CODE19和陽(yáng)性對(duì)照均有藍(lán)-綠色菌落。

在TSA平板上，阪崎腸桿菌可以產(chǎn)生黃色素。結(jié)果顯示，CODE12在TSA平板上為無(wú)色菌落，CODE19藍(lán)-綠色菌落轉(zhuǎn)種后在TSA平板上為黃色菌落，CODE19黑色菌落轉(zhuǎn)種后在TSA平板上為無(wú)色菌落，陽(yáng)性對(duì)照在TSA平板上為黃色菌落。

克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）干制生化鑒定試劑盒鑒定結(jié)果顯示，CODE12無(wú)色菌落和CODE19黑色菌落不符合阪崎腸桿菌生化反應(yīng)，CODE19藍(lán)綠色菌落和陽(yáng)性對(duì)照符合阪崎腸桿菌生化反應(yīng)。結(jié)合上述結(jié)果可以判定CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）。

梅里埃VIK E2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)上機(jī)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，CODE12鑒定為大腸埃希菌（Esch.coli），CODE19藍(lán)-綠色菌落（CODE19-1）鑒定為阪崎腸桿菌（Cro. sakazakii），CODE19黑色菌落（CODE19 -2）鑒定為奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）。

3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)從兩個(gè)角度設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)：第一，從增菌培養(yǎng)物中提取DNA，因有背景菌的干擾，選用阪崎腸桿菌特異性引物SAKA-F、SAKA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段（282 bp左右），如圖2所示泳道1-4，泳道1是以CODE12菌液DNA為模板，泳道2是以CODE19菌液DNA為模板，泳道3是以阪崎腸桿菌菌液DNA為模板，泳道4是陰性對(duì)照；第二，從純化后的TSA平板上單菌落提取DNA，選用細(xì)菌16SrRNA通用引物16S1VF、16SV3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段（500 bp左右），如圖2所示泳道6-11，泳道6是以CODE12菌落DNA為模板，泳道7是以CODE19藍(lán)-綠色菌落DNA為模板，泳道8是以CODE19黑色菌落黑色部分DNA為模板，泳道9是以CODE19黑色菌落無(wú)色部分DNA為模板，泳道10是以阪崎腸桿菌菌落DNA為模板，泳道11是陰性對(duì)照。

將全部有條帶擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序，進(jìn)一步確定微生物種類。

測(cè)序結(jié)果放到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行菌株的同源性比對(duì)，一致度越高說(shuō)明與該菌株同源性越接近，見(jiàn)表2，CODE12（編號(hào)6）與大腸埃希菌同源性接近，CODE19（編號(hào)2和編號(hào)7）與克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）同源性接近，結(jié)合生化鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。

4 討論

在分離鑒別克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）時(shí)，阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基比較關(guān)鍵。阪崎腸桿菌含有α-葡萄糖苷酶，可特異性分解5-溴-4氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡糖甙使菌落呈現(xiàn)藍(lán)-綠色[9]。此次能力驗(yàn)證提供的兩份樣品，CODE12只有一種無(wú)色菌落形態(tài)，CODE19不僅有藍(lán)-綠色菌落還有黑色菌落（無(wú)色菌落有黑色中心）。識(shí)別和排除非目標(biāo)菌的干擾可以有效考核能力驗(yàn)證參與者的水平。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)生化鑒定方法和PCR技術(shù)分別對(duì)黑色菌落進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定，最終鑒定為奇異變形桿菌。

能力驗(yàn)證檢品菌落特征一般都比較典型，容易區(qū)分不會(huì)弄錯(cuò)，但在實(shí)際工作中食品樣品中菌種未知且復(fù)雜，未知菌的確證鑒定也比較煩瑣，需要多方驗(yàn)證方知微生物種類，本實(shí)驗(yàn)提供的PCR實(shí)驗(yàn)思路，可以有效印證傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室按照GB 4789.40-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn) 》開(kāi)展試驗(yàn)，CODE12未檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），CODE19檢出克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌），結(jié)論為滿意，順利通過(guò)本次能力驗(yàn)證。本次設(shè)計(jì)的PCR實(shí)驗(yàn)達(dá)到預(yù)期效果，與GB 4789.40-2016結(jié)果相吻合。由此可見(jiàn)，PCR技術(shù)可以很好地應(yīng)用到食品克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)中去，兩相結(jié)合可以提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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作者簡(jiǎn)介

仇平平，碩士研究生，工程師，研究方向?yàn)槭称匪幤肺⑸餀z測(cè)。

田夢(mèng)，碩士研究生，工程師，研究方向?yàn)槭称匪幤肺⑸餀z測(cè)。

孫巧巧，本科，主管藥師，研究方向?yàn)槭称匪幤肺⑸餀z測(cè)。

（責(zé)任編輯：袁文靜）