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      乳粉中克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)能力驗(yàn)證PCR技術(shù)的探索

      2023-03-25 19:40:29仇平平田夢(mèng)孫巧巧
      中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化 2023年16期
      關(guān)鍵詞:能力驗(yàn)證乳粉

      仇平平 田夢(mèng) 孫巧巧

      摘 要:為提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的能力,本文依據(jù)NIFDC-PT-384乳粉中克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書(shū)、GB 4789.40-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn) 》,探索傳統(tǒng)生化方法和PCR技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的方法。結(jié)果表明,樣品CODE12未檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),樣品CODE19檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),結(jié)果均為滿意。本實(shí)驗(yàn)室具備檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的能力,PCR技術(shù)很好地印證了傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

      關(guān)鍵詞:乳粉,克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),能力驗(yàn)證,PCR技術(shù)

      DOI編碼:10.3969/j.issn.1002-5944.2023.16.028

      0 引言

      克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp.)是腸桿菌科內(nèi)一類短桿狀革蘭氏陰性菌,1980 年以前被稱為“產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌(yellow-pig mented Enterobacter cloacae)”,1980 年更名為阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii),2008年被重新定義為一個(gè)新屬,即克羅諾桿菌屬[1-2]。國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB4789.40-2016也做了相應(yīng)調(diào)整,由“阪崎腸桿菌”更名為“克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)”。阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)是一種條件致病菌,主要傳播媒介是奶粉,6月齡以下嬰兒是克羅諾桿菌屬的易感人群。嬰兒感染該菌后會(huì)引起菌血癥、腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎等,致死率高達(dá)40%-80%[3-5]。針對(duì)嬰幼兒食品的安全要求,國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 29921-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》中明確規(guī)定,嬰兒(0~6月齡)配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)不得檢出。

      近些年,克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的檢測(cè)技術(shù)也在快速發(fā)展,其中以PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)展最快[ 7- 8 ]。目前,克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的檢測(cè)主要是以傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法為主,如何將PCR技術(shù)和傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法結(jié)合起來(lái)應(yīng)用到日常工作中是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)的出發(fā)點(diǎn)。參照SN/T 1632.2-2013《出口奶粉中克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn)方法 第2部分:PCR方法》合成阪崎腸桿菌特異性引物SAFA-F、SAFA-R,參照《中國(guó)藥典》2020年版四部1021合成16SrRNA通用引物16SV1F、16SV3R,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,查看凝膠電泳結(jié)果,將PCR產(chǎn)物送至第三方機(jī)構(gòu)測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,簡(jiǎn)稱NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)尋找同源微生物,與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法結(jié)果比較,以期可以將PCR技術(shù)和傳統(tǒng)生化培養(yǎng)方法有效結(jié)合起來(lái),保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

      1 材料

      1.1 樣品

      樣品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供,2份待測(cè)樣品,每份樣品包含裝有菌球的西林瓶1瓶和相同編碼的乳粉1袋(規(guī)格:100克/袋),2份樣品分別編號(hào)為:CODE12和CODE19。

      1.2 培養(yǎng)基及試劑

      緩沖蛋白胨水(BPW)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(mLST)基礎(chǔ)及配套添加試劑萬(wàn)古霉素、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基(DFI瓊脂)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)干制生化鑒定試劑盒、氧化酶試紙及試劑、DNA提取裂解液,以上均采購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

      引物SAFA-F:GGGTTGTCTGCGAA GCGAA,SAFA-R:GTCTTGTGCTG CGAGTTTG;引物16SV1F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;引物16SV3R:GTATTACCGCGGCTGCTGGC(均由金唯智生物科技有限公司合成)。Premix Taq(TaKaRaTaqTM Version 2.0 plus dye)(品牌:TaKaRa),DL1000 DNA Marker(品牌:TaKaRa),瓊脂糖(品牌:IOWESTR),5×TBE緩沖液(品牌:SolarbioR),GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色劑(品牌:BIOTIUM)。

      1.3 儀器設(shè)備

      無(wú)菌均質(zhì)器(上海德記行科技發(fā)展公司)、DHP-9162B電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒儀器)、SPL -2 50生化培養(yǎng)箱(天津市萊波特瑞儀器)、VITEK2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(梅里埃)、H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器)、SVCJ-2G型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備)、T100定性PCR儀(品牌:伯樂(lè)BIO-RAD)、Powerpac Universa l通用電泳儀(品牌:伯樂(lè)BIO-RAD)、GelDoc EZ凝膠成像分析系統(tǒng)(品牌:伯樂(lè)BIORAD)。

      1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株

      阪崎腸桿菌 ATCC29544。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 樣品處理

      在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)樣品菌球的西林瓶,將西林瓶?jī)?nèi)的小球加入到盛有900 mL滅菌緩沖蛋白胨水(BPW)的無(wú)菌均質(zhì)袋中,充分溶解。然后再將與西林瓶相同編碼的乳粉樣品加入到上述緩沖蛋白胨水(BPW)中,充分混勻,作為樣品勻液。以阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽(yáng)性對(duì)照。

      2.2 前增菌、增菌和PCR實(shí)驗(yàn)

      2.2.1 前增菌

      將上述樣品勻液置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)18 h。

      2.2.2 增菌

      移取上述培養(yǎng)物1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(mLST-Vm)肉湯中,混勻,44 ℃培養(yǎng)24 h。

      2.2.3 菌液提取DNA模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)

      (1)菌液提取DNA。取前增菌液1 mL于1.5 mL離心管中,3000×g離心10 min,棄去上清,加入200 μL裂解液,渦旋混勻,沸水浴裂解10 min,冷卻后12000×g離心2 min,取上清即為模板。

      (2)特異性引物PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系Premix Taq(TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 25 μL,DNA模板2 μL,引物SAKA-F和引物SAKA-R(10 μmol/L)各1 μL,加無(wú)菌無(wú)酶水至總體積50 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。

      (3)凝膠電泳。用電泳緩沖液1×TA E制備1%瓊脂糖凝膠(冷卻至50 ℃左右加入GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色劑),取PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣,用DL1000DNA Marker做參照。3 V/cm~5 V/cm恒壓電泳,電泳30 min~60 min,用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

      (4)測(cè)序。將擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

      2.3 分離

      上述mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物,輕搖混勻,用接種環(huán)取1環(huán),劃線接種于阪崎顯色培養(yǎng)基平板上,平行劃線接種兩個(gè)平板,36 ℃,培養(yǎng)24 h。

      挑取5個(gè)可疑菌落,劃線接種于TSA平板上,25 ℃,培養(yǎng)48 h。

      2.4 鑒定

      挑取TSA平板上黃色可疑菌落,選用商品化的生化鑒定試劑和梅里埃VIKE2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)上機(jī)鑒定進(jìn)行生化鑒定。

      菌落提取DNA模板:用接種環(huán)取一環(huán)純化后的菌落,溶于200 μL裂解液中,渦旋混勻,沸水浴裂解10 min,冷卻后12000×g離心2 min,取上清即為模板。

      16?S通用引物PCR 擴(kuò)增:反應(yīng)體系Premix Taq(TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye)25 μL,DNA模板2 μL,引物16S1VF和引物16SV3R(10μmol/L)各1 μL,加無(wú)酶無(wú)菌水至總體積50 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。凝膠電泳和測(cè)序同2.2.3。

      3 結(jié)果與分析

      3.1 生化鑒定結(jié)果

      采用商品化生化鑒定試劑盒和梅里埃VIKE2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,本次能力驗(yàn)證CODE12未檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),CODE19檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),與中檢院的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致,結(jié)果滿意。

      在阪崎腸桿菌顯色平板上,克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)呈現(xiàn)藍(lán)-綠色,如圖1(a)、(b)、(c)所示,CODE12為無(wú)色菌落,CODE19和陽(yáng)性對(duì)照均有藍(lán)-綠色菌落。

      在TSA平板上,阪崎腸桿菌可以產(chǎn)生黃色素。結(jié)果顯示,CODE12在TSA平板上為無(wú)色菌落,CODE19藍(lán)-綠色菌落轉(zhuǎn)種后在TSA平板上為黃色菌落,CODE19黑色菌落轉(zhuǎn)種后在TSA平板上為無(wú)色菌落,陽(yáng)性對(duì)照在TSA平板上為黃色菌落。

      克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)干制生化鑒定試劑盒鑒定結(jié)果顯示,CODE12無(wú)色菌落和CODE19黑色菌落不符合阪崎腸桿菌生化反應(yīng),CODE19藍(lán)綠色菌落和陽(yáng)性對(duì)照符合阪崎腸桿菌生化反應(yīng)。結(jié)合上述結(jié)果可以判定CODE19檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),CODE12未檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)。

      梅里埃VIK E2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)上機(jī)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1,CODE12鑒定為大腸埃希菌(Esch.coli),CODE19藍(lán)-綠色菌落(CODE19-1)鑒定為阪崎腸桿菌(Cro. sakazakii),CODE19黑色菌落(CODE19 -2)鑒定為奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)。

      3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

      本實(shí)驗(yàn)從兩個(gè)角度設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn):第一,從增菌培養(yǎng)物中提取DNA,因有背景菌的干擾,選用阪崎腸桿菌特異性引物SAKA-F、SAKA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段(282 bp左右),如圖2所示泳道1-4,泳道1是以CODE12菌液DNA為模板,泳道2是以CODE19菌液DNA為模板,泳道3是以阪崎腸桿菌菌液DNA為模板,泳道4是陰性對(duì)照;第二,從純化后的TSA平板上單菌落提取DNA,選用細(xì)菌16SrRNA通用引物16S1VF、16SV3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段(500 bp左右),如圖2所示泳道6-11,泳道6是以CODE12菌落DNA為模板,泳道7是以CODE19藍(lán)-綠色菌落DNA為模板,泳道8是以CODE19黑色菌落黑色部分DNA為模板,泳道9是以CODE19黑色菌落無(wú)色部分DNA為模板,泳道10是以阪崎腸桿菌菌落DNA為模板,泳道11是陰性對(duì)照。

      將全部有條帶擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序,進(jìn)一步確定微生物種類。

      測(cè)序結(jié)果放到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行菌株的同源性比對(duì),一致度越高說(shuō)明與該菌株同源性越接近,見(jiàn)表2,CODE12(編號(hào)6)與大腸埃希菌同源性接近,CODE19(編號(hào)2和編號(hào)7)與克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)同源性接近,結(jié)合生化鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。

      4 討論

      在分離鑒別克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)時(shí),阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基比較關(guān)鍵。阪崎腸桿菌含有α-葡萄糖苷酶,可特異性分解5-溴-4氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡糖甙使菌落呈現(xiàn)藍(lán)-綠色[9]。此次能力驗(yàn)證提供的兩份樣品,CODE12只有一種無(wú)色菌落形態(tài),CODE19不僅有藍(lán)-綠色菌落還有黑色菌落(無(wú)色菌落有黑色中心)。識(shí)別和排除非目標(biāo)菌的干擾可以有效考核能力驗(yàn)證參與者的水平。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)生化鑒定方法和PCR技術(shù)分別對(duì)黑色菌落進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定,最終鑒定為奇異變形桿菌。

      能力驗(yàn)證檢品菌落特征一般都比較典型,容易區(qū)分不會(huì)弄錯(cuò),但在實(shí)際工作中食品樣品中菌種未知且復(fù)雜,未知菌的確證鑒定也比較煩瑣,需要多方驗(yàn)證方知微生物種類,本實(shí)驗(yàn)提供的PCR實(shí)驗(yàn)思路,可以有效印證傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

      5 結(jié)論

      本實(shí)驗(yàn)室按照GB 4789.40-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn) 》開(kāi)展試驗(yàn),CODE12未檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),CODE19檢出克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌),結(jié)論為滿意,順利通過(guò)本次能力驗(yàn)證。本次設(shè)計(jì)的PCR實(shí)驗(yàn)達(dá)到預(yù)期效果,與GB 4789.40-2016結(jié)果相吻合。由此可見(jiàn),PCR技術(shù)可以很好地應(yīng)用到食品克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn)中去,兩相結(jié)合可以提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

      參考文獻(xiàn)

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      作者簡(jiǎn)介

      仇平平,碩士研究生,工程師,研究方向?yàn)槭称匪幤肺⑸餀z測(cè)。

      田夢(mèng),碩士研究生,工程師,研究方向?yàn)槭称匪幤肺⑸餀z測(cè)。

      孫巧巧,本科,主管藥師,研究方向?yàn)槭称匪幤肺⑸餀z測(cè)。

      (責(zé)任編輯:袁文靜)

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