乳桿菌體外降解膽固醇特性研究

劉劍橋，吳酉芝，冉軍艦，趙瑞香，梁新紅，段旭

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品學(xué)院，上海金山 201514）

0 引言

膽固醇又叫膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物[1]，最早在18世紀(jì)發(fā)現(xiàn)于膽石中[2]。人體中膽固醇的來源有兩種，一種是由人體內(nèi)合成，另一種從食物中獲取而來。近年來，隨著人們生活水平的提高，攝入動物類食品每年都以驚人的速率增加，體內(nèi)膽固醇過多[3]，從而產(chǎn)生各種疾病，如造成動脈硬化，引起心血管疾病。

有研究表明，降低血脂中總膽固醇的含量能夠減少患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]由于藥物治療會給人體造成損傷，手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)大[6]。近年來大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，乳桿菌及相關(guān)的制品具有降膽固醇的能力[7]。研究者從酸奶[8-9]、發(fā)酵芥菜[10]、傳統(tǒng)發(fā)酵乳[11]、新生兒糞便[12]、發(fā)酵豆醬[13]等分離的乳酸菌去膽固醇效果很好；實(shí)驗(yàn)室保存的菌種[14]也有較高的去除膽固醇的能力，LEE等[15]研究了61株益生菌均有降解膽固醇的能力，其中有20株益生菌降膽固醇的能力達(dá)到了27%以上，其中植物乳桿菌MA2降膽固醇能力最高達(dá)到了50%以上。

本文研究了嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌體外降解膽固醇的能力、耐酸性、疏水性、自凝聚力、耐膽鹽能力、膽鹽水解酶的活性和不同金屬離子的不同濃度對膽固醇的降解率以及降解能力，以期為乳桿菌體外降解膽固醇提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum zrx03）、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus zrx02)、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus zxr01）保藏于河南科技學(xué)院食品學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備

主要試劑：牛膽鹽、膽固醇、?；敲撗跄懰徕c，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；硫代乙醇酸鈉，上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈣，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸鐵銨，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

M RS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，無水葡萄糖20 g，無水乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸錳0.25 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，牛肉浸粉10 g，酵母膏5 g，吐溫80 1 mL，p H 6.2～6.4，121℃滅菌30 min。

膽固醇溶液[16]：準(zhǔn)確稱量1 g膽固醇于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至100 mL，在無菌條件下用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

MRS-CHOL液體培養(yǎng)基[17]：在MRS培養(yǎng)基中加入0.3%的牛膽鹽，滅菌后加入膽固醇溶液，使培養(yǎng)基中的膽固醇溶液濃度為0.1 g/L。

儀器與設(shè)備：ZHWY-211恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；GeneScience E200厭氧培養(yǎng)箱，重慶江雪科技有限公司；3-30 K臺式高速離心機(jī)，德國Sigma公司；SW-CJ-1D(經(jīng)濟(jì)型)單人單面垂直凈化工作臺，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；G9800A酶標(biāo)儀，美國Thermol公司；Model PHS-3C型p H計(jì)，上海盛磁儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化以及培養(yǎng)

取凍藏于-80℃冰箱里的3株乳桿菌劃線培養(yǎng)，挑培養(yǎng)皿中的單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h，按照體積分?jǐn)?shù)1%的接種量于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，備用。

1.2.2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考GB/T 5009.128-2003《食品中膽固醇的測定》。

1.2.3 3株乳桿菌的膽固醇降解率

取活化兩次后的菌液按照5%接種于MRSCHOL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，取MRS-CHOL培養(yǎng)物0.2 mL于10 mL離心管中，向離心管中加入4.8 mL無水乙醇（沿離心管壁緩緩加入）。靜置15 min后，9 500 r/min離心10 min。吸取上清液2 m L（注意緩慢吸?。┯谠嚬苤?，再加入2 mL鐵釩顯色劑溶液，用移液槍緩慢吹打均勻，冷卻到室溫后，在15～90 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀測其在560 nm下測吸光值，以2 mL無水乙醇加入2 mL鐵釩溶液作為空白調(diào)零，以不接菌種的MRS-CHOL的液體培養(yǎng)基作為對照，做3組平行試驗(yàn)。對照組膽固醇濃度CA減去測定的膽固醇濃度CB即可得到3株乳酸菌降解膽固醇的濃度，由此可得到3株乳酸菌膽固醇降解率的公式：

1.2.4 3株乳桿菌的耐酸性

將配制好的MRS溶液p H調(diào)至6.0,5.0,4.0,3.0，將活化兩次后的菌液按照體積分?jǐn)?shù)為5%接入上述pH值的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h后，以未接種的MRS培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，測3株乳桿菌在不同p H的在600 nm處的吸光值，以p H=6.0的作為對照。菌株的耐酸性：

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組的OD600 nm；A2為對照組的OD600 nm。

1.2.5 3株乳桿菌的疏水性

將活化兩次后的菌株按照體積分?jǐn)?shù)為5%接入MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18 h。取適量菌液于50 mL離心管中在4℃，10 000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清，用p H=6.2的PBS緩沖液洗滌菌體2次，在用PBS緩沖液重新懸浮菌沉淀。用PBS緩沖液調(diào)整菌體濃度（以PBS緩沖液為空白對照調(diào)零），使其在600 nm處吸光度為1.00±0.05，并測其準(zhǔn)確OD值。將菌懸液中加入三氯甲烷（4∶1，體積比），在旋渦混合儀上渦旋30 s，室溫下靜置10 min分層。測菌體在600 nm處的吸光度。乳酸菌疏水能力的計(jì)算：

式中：A1是與三氯甲烷混勻前菌液OD 600nm；A2是與三氯甲烷混勻后菌液OD600nm。

1.2.6 3株乳桿菌的自凝聚力

菌株按照5%(體積比)接種于MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h。取適量菌液于50 mL離心管中，在4℃，10 000 r/min離心10 min后棄掉上清，用p H=6.2的PBS緩沖液洗滌兩次，將菌液沉淀重懸。用PBS緩沖液調(diào)整菌體濃度，使其在600 nm波長下的OD值為1.00±0.05（以p H=6.2的PBS緩沖液為空白對照調(diào)零），并測其準(zhǔn)確OD值，記為A1。取4 m L調(diào)整濃度后的菌液于10 mL離心管中，將離心管置于生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，測3株乳桿菌靜置1 h，24 h上清液在600 nm的吸光值，記為A2。

1.2.7 3株乳桿菌的耐膽鹽能力測定

將活化兩次后的菌株按照5%的體積比接種于不加牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基以及加入含0.05%、0.3%牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，以不加膽鹽的MRS培養(yǎng)基對照組和不加同膽鹽的MRS培養(yǎng)基試驗(yàn)組，測對照組和試驗(yàn)組在600 nm處的吸光值（以未接菌種的MRS培養(yǎng)基做空白對照調(diào)零）。

式中：A1為3株乳桿菌在不加膽鹽的MRS培養(yǎng)基600 nm處的吸光值；A2為3株乳桿菌在含不同膽鹽的MRS培養(yǎng)基600 nm處的吸光值。

1.2.8 3株乳桿菌膽鹽水解酶的測定

采用郭均[18]的方法并進(jìn)行微調(diào)，在剛配制好的MRS培養(yǎng)基中加入0.3%的?；敲撗跄懰徕c、0.37 g/L的氯化鈣、0.2%的硫代乙醇酸鈉、2%的瓊脂，121℃滅菌30 min。滅過菌后倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后，將事先準(zhǔn)備好已滅過菌的濾紙片放入培養(yǎng)皿中，在每個濾紙片上加入40μL活化兩次后的菌液的菌液，放置在厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h。用不加?；敲撗跄懰徕c的作對照。對照組無明顯現(xiàn)象，試驗(yàn)組產(chǎn)生白色沉淀，則菌株能產(chǎn)生膽鹽水解酶。

1.2.9 陽離子對3株乳桿菌降膽固醇的影響

1.2.9.1 陽離子氯化物的配制

準(zhǔn)確稱取氯化鈉9.35 g、氯化鉀11.93 g、氯化鈣8.88 g、氯化鎂7.60 g、氯化鋁7.11 g分別溶于蒸餾水中并于100 mL容量瓶中定容至100 mL,配制成各自貯存液，使溶液中金屬陽離子的當(dāng)量濃度均為1.6 N（為了保證各處理組中陰離子即Cl-濃度一致，試驗(yàn)中采用當(dāng)量濃度作為單位），0.22μm微孔濾膜過濾除菌后紫外殺菌30 min。

1.2.9.2 陽離子對乳桿菌降膽固醇的影響及降解效力的測定

將上述不同氯化物陽離子的溶液按照10%加入MRS-CHOL液體培養(yǎng)基中，使陽離子當(dāng)量濃度為0.02、0.04、0.08、0.16 N，在將活化兩次后的菌液按照5%加入其中，37℃培養(yǎng)24 h。測定不同濃度下的膽固醇降解率和降解效力，膽固醇降解率的計(jì)算同1.2.3。膽固醇降解效力參考王菁的方法[19]。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，用Excel和Origin2019作圖，所有結(jié)果按平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 3株乳桿菌體外膽固醇降解率

由圖2可知，3株乳桿菌都有降解膽固醇的能力，但是對膽固醇的脫除能力各不相同，脫除率越高的說明體外降解膽固醇的能力越強(qiáng)。嗜酸乳桿菌的膽固醇降解率為28.87%、鼠李糖乳桿菌為25.61%、植物乳桿菌為20.39%。龍竣瑤等[20]從六堡茶中篩選降膽固醇菌株時，發(fā)現(xiàn)乳酸菌膽固醇去除率為0～30%，表明3株乳桿菌都有降解膽固醇的能力，且降解膽固醇的能力大小排序?yàn)椋菏人崛闂U菌>植物乳桿菌>鼠李糖乳桿菌。

圖2 3株乳桿菌降膽固醇

2.2 3株乳桿菌的耐酸性

由圖3可知，3株乳桿菌的耐酸性隨著p H值的降低3株乳桿菌的生長情況下降，3株乳桿菌的耐酸性存活率因pH值不同也存在著差異。人們在食用食物后，胃液的p H值在1.8～5.0的范圍內(nèi)不斷變化，一般認(rèn)為胃液的p H值為3.0[18]。嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌在p H值為3時3株乳桿菌的都能存活，但是耐酸性存活率分別為52.77%、52.57%、59.82%，鼠李糖乳桿菌的耐酸性存活率和嗜酸乳桿菌差異不大，略低于植物乳桿菌。在相同的p H值下植物乳桿菌的生長情況要較優(yōu)于嗜酸乳桿菌遠(yuǎn)優(yōu)于鼠李糖乳桿菌，但是在p H值為3和4時3株乳桿菌的耐酸性存活率的差異不大，pH值為5時鼠李糖乳桿菌的耐酸性存活率要高于其它兩株乳桿菌。郭心悅等[21]從金針菇分離得到的菌株4J17在p H值為3時的耐酸性存活率僅為20.00%。本試驗(yàn)測得3株乳桿菌在p H值為3時3株乳桿菌存活率均在50%以上，表明3株乳桿菌的耐酸性較強(qiáng)。

圖3 3株乳桿菌的耐酸性

2.3 3株乳桿菌的的疏水性

益生菌對腸上皮細(xì)胞的黏附能力與疏水性和自凝聚力之間存在著正相關(guān)性[25-26]。

本研究以三氯甲烷為吸附劑研究了3株乳桿菌的疏水性。由圖4可以看出，嗜酸乳桿菌，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的疏水性依次為19.88%，10.41%和13.82%。嗜酸乳桿菌的疏水性最強(qiáng)，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的疏水性較低。降初祝瑪[22]等研究的乳酸菌株編號266的疏水性僅為2.3%，表明3株乳桿菌有較好的疏水性，3株乳桿菌疏水性大小為：嗜酸乳桿菌>植物乳桿菌>鼠李糖乳桿菌。

圖4 3株乳桿菌的疏水性

2.4 3株乳桿菌的自凝聚力

由圖5可以看出，隨著時間的增加植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的自凝聚力會提高。菌株靜置1 h后3株乳桿菌的自凝聚力不是特別明顯，嗜酸乳桿菌的自凝聚力為8.59%、鼠李糖乳桿菌為6.70%、植物乳桿菌為9.66%。3株乳桿菌靜置24 h后，植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的自凝聚力都超過了80%，但是鼠李糖乳桿菌的自凝聚力僅有65.47%?，旣惸取鞝柭黐23]等從傳統(tǒng)酵素中分離出來的菌株M-16的自凝聚力不到60%，本試驗(yàn)測得3株乳桿菌自凝聚力均超過了60%。菌株的自凝聚力是由疏水性決定的，同時與黏附性呈正相關(guān)。所以對腸上皮細(xì)胞的黏附性強(qiáng)弱順序?yàn)椋菏人崛闂U菌>植物乳桿菌>鼠李糖乳桿菌。

圖5 菌株的自凝聚力

2.5 3株乳桿菌的的耐膽鹽能力

由于人體的腸道內(nèi)膽汁的濃度總是在時刻的變化著，但是其含量總在0.03%～0.3%的范圍內(nèi)變化[24]。所以本文選擇了0.05%和0.3%的兩個牛膽鹽濃度作為菌株的檢驗(yàn)條件。

由圖6可知，在牛膽鹽含量為0.05%時，植物乳桿菌的耐膽鹽能力是最高的，說明在人體腸道內(nèi)膽汁濃度低時，植物乳桿菌的生長情況最好。在牛膽鹽含量為0.3%時，嗜酸乳桿菌的耐膽鹽能力最好為28.65%，但是鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌存活率分別為27.40%和26.04%，只是略低于嗜酸乳桿菌，3株乳桿菌在人體腸道內(nèi)能夠生長。朱奇奇[25]等從分離出來的植物乳桿菌I4在膽鹽為0.3%時，幾乎沒有生長，表明3株乳桿菌有較好的膽鹽耐受性。

圖6 3株乳桿菌在0.05%和0.3%的牛膽鹽的存活率

2.6 3株乳桿菌膽鹽水解酶活性的測定

膽鹽水解酶能將腸道中的結(jié)合態(tài)的膽鹽水解為游離膽酸和氨基酸，游離的膽酸能與膽固醇形成復(fù)合體，從而降解膽固醇。所以膽鹽水解酶作為篩選膽固醇菌株的一個重要判定指標(biāo)[5,7,23]。由圖7可知，將濾紙片取下后，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的濾紙片下方均產(chǎn)生了白色沉淀而對照組沒有白色沉淀，這是因?yàn)槟扄}水解酶將培養(yǎng)皿中添加的結(jié)合態(tài)的膽鹽水解為游離的膽鹽，而游離的膽鹽與CaCl2中的Ca2+結(jié)合形成沉淀，郭均[18]研究的干酪乳桿菌、植物乳桿菌膽鹽水解酶試驗(yàn)產(chǎn)生了白色沉淀，說明3株乳桿菌均可以產(chǎn)生膽鹽水解酶。因此說明這3株乳桿菌均有膽鹽水解酶活性。

圖7 3株乳桿菌的膽鹽水解酶活性的測定

2.7 不同金屬陽離子對乳桿菌降膽固醇的影響

生活中與人體生活息息相關(guān)的各種金屬離子對乳酸菌的生長情況會因其不同種類及不同濃度有促進(jìn)和抑制作用[19]。乳酸菌的生長情況會影響其對膽固醇的降解率和效果，金屬離子通過影響乳酸菌的生長情況而影響對膽固醇的降解率和效果。

據(jù)研究表明Na+、K+在體外對分離純化的膽鹽水解酶有激活作用但是不明顯[26]，Ca2+、Mg2+在體外對分離純化的膽鹽水解酶有激活作用較大[27]，Al3+對膽鹽水解酶的活性有抑制作用[26]。

2.7.1 一價陽離子（Na+、K+）對乳桿菌降膽固醇的影響

由圖8可以看出，隨著Na+氯化物在MRSCHOL培養(yǎng)基添加濃度的升高，嗜酸乳桿菌的膽固醇的降解率先升高在降低，其降解效力先降低在升高在降低，在濃度為0.04 N時降解率及降解效力最高，而鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌則隨著Na+濃度的升高膽固醇降解率以及降解效力不斷降低。隨著K+氯化物在MRS-CHOL培養(yǎng)基添加濃度的升高嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌膽固醇降解率和降解效力不斷降低。

2.7.2 二價陽離子（Ca2+、Mg2+）對乳桿菌降膽固醇的影響

由圖9可知，隨著Ca2+、Mg2+氯化物MRS-CHOL培養(yǎng)基中添加濃度的升高，嗜酸乳桿菌的膽固醇降解率呈現(xiàn)先升高后降低，在濃度為0.02 N時膽固醇降解率最高，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的膽固醇降解率隨著離子濃度的升高而呈現(xiàn)不斷降低的趨勢；嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的降解效力隨著離子濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，降解效力均在濃度為0.02 N時最高。

2.7.3 三價陽離子（Al3+）對乳桿菌降膽固醇的影響

由圖10可知，在添加Al3+的MRS-CHOL培養(yǎng)基中，嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的降解率隨著添加Al3+濃度的增加呈現(xiàn)不斷降低的趨勢，嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌接植物乳桿菌的降解效力隨著濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在濃度為0.02 N時降解效力最高。

圖1 膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖10 三價陽離子對乳桿菌降膽固醇的影響

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究表明3株乳桿菌均有降解膽固醇的能力，但是降解膽固醇的能力不同，嗜酸乳桿菌膽固醇降解率為28.52%明顯高于鼠李糖乳桿菌的25.61%和植物乳桿菌為20.39%。通過耐酸性的研究，在p H值為3時嗜酸乳桿菌耐酸性存活率為52.77%、植物乳桿菌為52.57%略低于鼠李糖乳桿菌為59.82%。嗜酸乳桿菌的疏水性和24 h自凝聚力為19.88%、82.33%高于鼠李糖乳桿菌10.41%、65.47%和植物乳桿菌13.82%、80.96%，說明嗜酸乳桿菌對腸上皮細(xì)胞的黏附性高于鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。在膽鹽濃度為0.3%時，嗜酸乳桿菌的存活率28.65%高于鼠李糖乳桿菌的27.40%和植物乳桿菌的26.04%。3株乳桿菌都能產(chǎn)膽鹽水解酶，說明3株乳桿菌都是產(chǎn)膽鹽水解酶水解膽鹽與膽固醇發(fā)生共沉淀降解膽固醇。

研究金屬陽離子對3株乳桿菌膽固醇降解率的影響選擇了Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+5種金屬陽離子。研究發(fā)現(xiàn)，在MRS-CHOL培養(yǎng)基中添加不同的金屬陽離子，對3株乳桿菌的降解膽固醇的影響不一致，與不添加金屬陽離子氯化物的相比，只有添加Na+在0.04 N時和Ca2+、Mg2+濃度為0.02 N時嗜酸乳桿菌膽固醇降解率最高，其余都是隨著添加金屬離子濃度增高呈現(xiàn)降低趨勢。添加Ca2+、Mg2+、Al3+的MRSCHOL培養(yǎng)基中，在濃度為0.02 N時，3株乳桿菌的降解效力最高，而添加Na+的MRS-CHOL培養(yǎng)基中，在其濃度為0.04 N時，嗜酸乳桿菌的降解效力最高，而其它兩株菌的降解效力和添加K+的MRSCHOL培養(yǎng)基中對3株乳桿菌的降解效力隨著濃度升高而呈現(xiàn)一直降低的趨勢。不同離子及濃度對3株乳桿菌膽固醇降解率及降解效力的不同有可能是以下幾個原因：（1）生物吸附：乳酸菌的細(xì)胞壁、胞外聚合物和細(xì)胞膜通過離子交換、螯合、吸附和透過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的擴(kuò)散吸附金屬[28-29]。(2)生物轉(zhuǎn)化：乳酸菌通過氧化、還原、甲基化、去甲基化等轉(zhuǎn)化作用降低金屬離子的毒性，從而影響對乳酸菌膽固醇去除的效果[19,30]。（3）胞外沉淀：乳酸菌通過其生理活動產(chǎn)生能和金屬離子結(jié)合的物質(zhì),這些物質(zhì)能和金屬離子結(jié)合形成穩(wěn)定難溶的化合物或絡(luò)合物而沉淀聚集在細(xì)胞的表面[31]（4）添加的金屬離子與MRS-CHOL培養(yǎng)基中的物質(zhì)反應(yīng)來影響乳桿菌膽固醇去除的效果[19]。

通過對3株乳桿菌體外降解膽固醇以及金屬陽離子對3株乳桿菌膽固醇降解率及降解效力，益生特性以膽鹽水解酶的研究，為人體進(jìn)一步研究嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌體外降解膽固醇提供了理論參考，為3株乳桿菌在體外模擬試驗(yàn)中提供了依據(jù)和開發(fā)降膽固醇食品提供材料。