不同來源乳中乳鐵蛋白含量的高通量毛細管凝膠電泳檢測

路夢凡，孫娜娜，李香云，李漢芳，徐丹，徐秦峰

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院國家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，西安 710021；2.西安喜洋洋生物科技有限公司，西安 710021）

0 引 言

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種活性蛋白[1-4]，已廣泛添加在嬰幼兒配方食品和保健品中[5-7]。在不同物種來源乳中LF的含量差異很大，并且受加工工藝影響[8-10]。因此檢測各種特色乳品中LF的含量對其營養(yǎng)價值的評估十分有必要。

目前，已經(jīng)建立了多種牛源LF的檢測方法[11-14]。其中，高效液相色譜法可以用來測定不同來源乳中LF的含量[9,15-18]，但由于其對樣品的純度要求較高，需用肝素親和柱對樣品進行前處理，并且經(jīng)純化后的生鮮羊乳和人乳樣品，其他蛋白依然存在干擾[9]。同樣地，高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用也能夠?qū)Σ煌瑏碓慈橹械腖F進行分析[19]，但設備昂貴，對操作人員要求較高，缺少廣泛地適用性。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法電泳分離，也可以半定量不同來源乳中LF含量[20]，但該方法每次檢測的樣品數(shù)量有限，操作繁瑣且耗時長。因此，目前仍缺少快速、簡便、高通量、無需復雜樣品前處理的，具有普適性的不同來源乳中的LF含量檢測方法。

本研究在前期建立的全自動高通量毛細管凝膠電泳檢測牛源乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，BLF）的基礎(chǔ)上[21-22]，通過篩選分別能夠與人源乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）、羊源乳鐵蛋白（goat lactoferrin，GLF）特異性結(jié)合的DNA序列，將方法進一步拓展到了HLF、GLF的定性定量檢測，驗證了該方法的普適性，為不同來源特色乳中LF含量檢測提供新方案。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DNA1[23]（5'-TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC TTC CTC-3'）、DNA2[24]（5'-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3'）、DNA3[25]（5'-TAG AAG ATC AAA-3'），由上海生工生物工程公司；DL500 bp DNA marker（Takara），100×TE緩沖液以及磷酸鹽緩沖液PBS（Sigma-Aldrich），人源乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、α1-抗胰蛋白酶（α-antitrypsin from human plasma，AAT）、纖維蛋白原（Fibrinogen from human plasma，F(xiàn)ib）、血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、α-乳白蛋白（α-lactabumin，α-Lac）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）、酪蛋白（Casein），Sigma-Aldrich；羊源乳鐵蛋白（goat lactoferrin，GLF），西安優(yōu)博（YOB IOS）；全自動高通量毛細管凝膠電泳儀器（Qsep1）及卡夾臺灣光鼎（Bioptic）公司。

1.2 實驗材料

實驗中所用到的母乳來源于自愿參加此研究的志愿者，羊奶粉購于西安市某超市，液態(tài)乳樣品冰箱4℃儲存待用，奶粉樣品常溫儲存待用。

1.3 檢測方法

DNA序列處理：實驗中的DNA序列由1×TE緩沖液溶解至100μmol/L，1×PBS稀釋至1μmol/L。為獲得具有功能性的DNA序列的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，使用前對DNA序列進行95±0.5℃，5 min退火處理，冰箱-20℃下2 min冷卻待用。

選取出的非標記-DNA序列（0.5μmol/L）加入濃度梯度（0～150μg/mL）HLF（1 mg/mL），加入1.0μL 20×PBS，加入超純水至最終體系為20μL，混勻孵育30 min后進行全自動毛細管凝膠電泳檢測。GLF的樣品檢測濃度為0～25μg/mL。

全自動毛細管凝膠電泳檢測參數(shù)為：LED激發(fā)光源：480 nm；檢測器：PMT熒光檢測器；進樣電壓：4 k V；進樣時間：10 s；分離電壓：8 k V；分離時間：240 s；毛細管的有效分離長度為13 cm。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：樣品中加入2μL SYBR Gold染料（20×）以及3μL上樣緩沖液（6×）后進行電泳。電泳參數(shù)：1%的瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，電壓為100 V，電泳時間為30 min。電泳結(jié)束后使用藍光透射儀觀察電泳結(jié)果。

1.4 實際樣品檢測

實際樣品前處理：新鮮母乳在4℃，12 000 rcf離心處理10 min，取中間層；嬰幼兒奶粉溶解方式為稱取1 g奶粉用超純水定容至7 mL，4℃，12 000 rcf離心處理10 min，取中間層。

實際樣品檢測：用所建立的檢測HLF、GLF的方法，分別檢測新鮮母乳（取0.5μL）、嬰幼兒奶粉（取3μL）中LF含量。在實際樣品中加入LF標準品進行加標回收檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源乳鐵蛋白的毛細管凝膠電泳檢測

在凝膠電泳遷移實驗中，選取合適的DNA序列對LF檢測的成功實現(xiàn)至關(guān)重要。在前期LF檢測中采用的是針對牛源LF的特異性DNA結(jié)合序列[21,24]，但是由于人LF和牛LF的蛋白質(zhì)氨基酸序列僅具有69%的同源性，因此，DNA序列篩選實驗中增加另外兩種能與HLF特異性結(jié)合的DNA序列（DNA2、DNA3）[23,25]。由于毛細管凝膠電泳遷移實驗中無法觀察到復合物的電泳峰[21]，采用瓊脂糖凝膠電泳表征了上述3條DNA序列用于HLF檢測的可行性。實驗結(jié)果如圖1（a）所示，3條DNA序列在高濃度HLF存在時，均能夠觀察到明顯的復合物條帶，但是對于低濃度HLF，只有DNA1和DNA2能夠出現(xiàn)復合物條帶，并且DNA2在高濃度HLF時，觀察到二聚體條帶，影響HLF的準確定量，因此選用DNA1進行HLF的毛細管凝膠電泳檢測。

由于毛細管凝膠中已經(jīng)包含了DNA染料，本實驗中直接采用了非標記的DNA序列，相比于之前采用的熒光標記DNA[21]，顯著降低了檢測試劑成本。將上述選取的DNA1序列分別和不同濃度的HLF標準品孵育后進行毛細管凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1（b）所示。不同濃度的HLF與DNA1序列混合的樣品及陰性樣品均出現(xiàn)DNA1序列的峰。由于HLF和DNA1序列特異性結(jié)合，導致體系中剩余的游離DNA1序列減少，含有HLF的樣品的游離DNA信號和峰面積明顯低于不含HLF的樣品，與前期BLF檢測實驗結(jié)果一致[21]。驗證了采用非標記DNA序列進行HLF定量檢測的可行性。

當增加HLF的濃度時，觀察到了預期的游離DNA1電泳峰高降低圖1（b）。以HLF的濃度（μg/mL）為橫坐標，游離DNA1的峰面積為縱坐標繪制工作曲線，線性范圍0～150μg/mL，檢出限11.74μg/mL圖1（c）。特異性實驗結(jié)果如圖1（d）所示，只有含HLF的樣品和DNA1序列特異性結(jié)合使得游離DNA1序列的峰面積明顯減少。因此，所建立的毛細管凝膠電泳方法能夠用于HLF含量的特異性定量檢測。

圖1 HLF毛細管凝膠電泳檢測的DNA序列選擇（a）、線性范圍（b）、（c）和特異性（d）

2.2 羊源乳鐵蛋白的毛細管凝膠電泳檢測

采用同樣的方式驗證了GLF的毛細管凝膠電泳檢測的可行性，實驗結(jié)果如圖2所示。與HLF不同，3條DNA序列中，DNA2對于低濃度GLF復合物電泳條帶現(xiàn)象最明顯圖2（a），因此后續(xù)選用DNA2序列用于毛細管凝膠電泳檢測GLF。隨著GLF濃度的增加，游離DNA2序列峰的面積減少，濃度在0～25μg/m L的范圍內(nèi)均具有良好的線性圖2（c），計算獲得檢出限3.53μg/m L，低于HLF的11.74μg/mL，表明該方法對于GLF具有更高的檢測靈敏度。同時，該方法也具有良好的特異性圖2（d）。

圖2 GLF毛細管凝膠電泳檢測的DNA序列篩選（a）、線性范圍（b）、（c）、特異性驗證（d）

2.3 實際乳品樣品檢測

為驗證本研究建立的毛細管凝膠電泳法檢測HLF、GLF的實用性，采用上述建立的方法對母乳及羊奶粉中的LF含量進行檢測，檢測結(jié)果見表1。新鮮母乳中LF的檢測值為3.25 mg/mL，且加標回收率為107.45%，與文獻報道相符[10]。羊奶粉中未檢出GLF，分別添加1、3、5μL羊乳鐵蛋白標準品（0.1 mg/m L），測得加標回收率為85.5%～114.9%。表明本研究建立的毛細管凝膠電泳可用于實際樣品中不同來源LF的簡便、快速、準確檢測。為添加LF的嬰幼兒配方奶粉以及特色乳營養(yǎng)價值評價提供一定的技術(shù)參考。

表1 實際樣品中乳鐵蛋白的檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

本實驗建立的毛細管凝膠電泳快速檢測HLF和GLF的方法，可實現(xiàn)母乳及羊奶粉等實際樣品中不同來源LF的定量檢測，提高了該方法的通用性。實驗中只需簡單的離心除脂以防止毛細管發(fā)生堵塞，不需要復雜的樣品前處理過程，簡化了操作，同時減小了樣品前處理過程中引入的誤差；用非標記DNA序列取代熒光標記的DNA序列，降低了檢測成本。本方法準確度高，重現(xiàn)性較好，適合工廠大批生產(chǎn)嬰幼兒配方羊奶粉及其它奶制品等添加LF含量的測定。同時，本方法用于多種特色乳源中LF的定量檢測具有很好的應用前景。