蓽茇酰胺抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究

黃微星 萬(wàn)玲君 黃幻 王威 雷新環(huán) 袁赤亭 章禮煒

骨骼作為人體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要器官，在體內(nèi)發(fā)揮著保護(hù)、代謝、支持、運(yùn)動(dòng)、造血等功能。在正常機(jī)體的骨代謝中，成骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨形成作用與破骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨吸收作用至關(guān)重要，使骨量維持在動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[1]。起源于骨髓單核巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞，是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的終末分化細(xì)胞。絕經(jīng)后的女性，由于體內(nèi)缺乏雌激素，使得破骨細(xì)胞數(shù)目增加及功能異常，骨吸收速度提高，出現(xiàn)明顯的骨量丟失現(xiàn)象，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[2]。此外，破骨細(xì)胞分化異常活躍在腫瘤骨轉(zhuǎn)移、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)置換假體周圍骨溶解等疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。由此可見(jiàn)，抑制破骨細(xì)胞分化是防治骨量丟失疾病的重要靶點(diǎn)之一。蓽茇酰胺提取自胡椒科胡椒屬植物蓽茇，是一種天然生物堿，具有抗腫瘤、抗血小板凝集、抗炎、降血脂、保護(hù)神經(jīng)等作用，但是其在骨代謝領(lǐng)域的功能尚未揭示[4-5]。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討蓽茇酰胺對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響及其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠10只，體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（滬）2018-0004]，飼養(yǎng)于浙江大學(xué)臺(tái)州醫(yī)院公共科研平臺(tái)SPF動(dòng)物房[SYXK（浙）2019-0030]。小鼠在室溫20～25℃，濕度40%～60%，24 h自然光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，不限制飲水及進(jìn)食，相關(guān)飼養(yǎng)及操作經(jīng)浙江大學(xué)臺(tái)州醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（tzyy-2019033）。

1.2 試劑和儀器 蓽茇酰胺粉末（批號(hào)：HY-N2329）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，高速離心后使用二甲基亞砜（批號(hào)：ST038，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）溶解制成100 mmol/L母液，分裝后置于-80℃冰箱保存。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（批號(hào)：315-02）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）（批號(hào)：P00226）、總 RNA 提取試劑（批號(hào)：R1100）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；α-改良型MEM培養(yǎng)基（批號(hào)：SH30265.01）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；澳洲特級(jí)FBS（批號(hào)：10099-141）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)：K1018）購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司；cDNA第一鏈合成試劑盒（批號(hào)：R123-01）、SYBR Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（批號(hào)：Q121-02）均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。PBS（批號(hào)：C0221）、胰酶細(xì)胞消化液（批號(hào)：C0201）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號(hào)：C0222）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；24孔Osteo Assay Surface骨細(xì)胞表面培養(yǎng)板（批號(hào)：3987）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；破骨細(xì)胞特征性標(biāo)志酶抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號(hào)：BZ-OC02）購(gòu)自蘇州必中生物科技有限公司。Multiskan SkyHigh全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，DM IL LED倒置實(shí)驗(yàn)室顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠骨髓來(lái)源單核巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived monocytes/macrophages，BMMs）提取與培養(yǎng) 解剖小鼠，收集小鼠脛腓骨置于無(wú)菌PBS中，剔凈肌肉、生長(zhǎng)板及黏附其上的韌帶等結(jié)締組織，3次無(wú)菌PBS漂洗后，于股骨近端、脛骨遠(yuǎn)端暴露骨髓腔，使用1 ml針筒抽取PBS反復(fù)沖洗骨髓腔。將分離的骨髓使用含10%血清的α-改良型MEM培養(yǎng)基重懸后1 500 r/min離心4 min，倒掉上清液后使用含30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基重懸，接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過(guò)夜。第2天去除細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并用無(wú)菌PBS沖洗3次，加入適量含30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基，將仍貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 d細(xì)胞呈短梭形，密度80%～90%。隨后去除培養(yǎng)液并使用PBS沖洗3次，胰酶消化，計(jì)數(shù)后備用，即為BMMs。后續(xù)BMMs培養(yǎng)均使用含30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基，進(jìn)行破骨分化誘導(dǎo)時(shí)采用含50 ng/ml RANKL、30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基。

1.3.2 BMMs增殖活性檢測(cè) 采用CCK-8法。將BMMs按0.4×104細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，設(shè)置1 個(gè) 對(duì)照組和9個(gè)濃度（0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 μmol/L）蓽茇酰胺干預(yù)組，共10組，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后，將孔內(nèi)液體更換為含對(duì)應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)，隔天換液1次。分別培養(yǎng)48、72、96 h后，向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度（OD450）值。

1.3.3 BMMs破骨分化誘導(dǎo) 將BMMs分別按10×104、40×104細(xì)胞/孔的密度接種于24、6孔板內(nèi)。過(guò)夜貼壁后，使用破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+50 ng/ml RANKL+30 ng/ml M-CSF）進(jìn)行破骨分化誘導(dǎo)，隔天換液。第4天顯微鏡下見(jiàn)BMMs開(kāi)始匯聚、融合，出現(xiàn)3個(gè)細(xì)胞核以上的細(xì)胞，第6天見(jiàn)邊界清晰、巨大、煎餅樣的成熟破骨細(xì)胞。

1.3.4 BMMs破骨分化能力檢測(cè) 采用TRAP染色。吸去成熟破骨細(xì)胞24孔板中各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，PBS沖洗1遍后加入500 μl 4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，隨后PBS沖洗2遍，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TRAP染色。倒置顯微鏡下觀察并拍照，TRAP陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)目≥3個(gè)的細(xì)胞計(jì)為破骨細(xì)胞，并通過(guò)Image J軟件進(jìn)行破骨細(xì)胞相對(duì)大小的計(jì)算，破骨細(xì)胞相對(duì)大小=各組破骨細(xì)胞大小/溶劑對(duì)照組中破骨細(xì)胞大小的平均值。

1.3.5 破骨細(xì)胞骨吸收能力檢測(cè) 采用24孔Osteo Assay Surface骨細(xì)胞表面培養(yǎng)板。將BMMs按10×104細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板中，細(xì)胞過(guò)夜貼壁后將培養(yǎng)基更換為破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，進(jìn)行破骨誘導(dǎo)，隔天換液。3 d后倒置顯微鏡下見(jiàn)BMMs開(kāi)始融合成較小的、不成熟的破骨細(xì)胞，隨后去除培養(yǎng)液并使用PBS沖洗3次，胰酶消化并重新進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。隨后，將消化后的未成熟破骨細(xì)胞按10×104細(xì)胞/孔的密度接種于Osteo Assay Surface骨細(xì)胞表面培養(yǎng)板中，共9孔，分為對(duì)照組和0.5、1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組，加入含對(duì)應(yīng)藥物的破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。最后使用5%次氯酸鈉清洗孔板，去除黏附的細(xì)胞，并用雙蒸水清洗2次。倒置顯微鏡下觀察骨板的骨吸收情況并拍照，通過(guò)Image J軟件進(jìn)行骨吸收相對(duì)面積的計(jì)算，相對(duì)骨吸收面積=結(jié)晶涂層吸收區(qū)域面積/同一視野下的總面積。

1.3.6 BMMs破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子活化T-細(xì)胞核因子1（nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1）及相關(guān)特征基因耐酒石酸酸性磷酸酶（acid phosphatase 5，tartrate resistant，ACP5）、破骨細(xì)胞相關(guān)受體（osteoclast associated receptor，OSCAR）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRTPCR法。將BMMs按40×104細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，過(guò)夜貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含對(duì)應(yīng)藥物的破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，進(jìn)行破骨誘導(dǎo)，隔天換液。6 d后吸去各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗1次后每孔加入500 μl總RNA提取試劑，置于冰上按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。RNA樣品使用RNA/DNA紫外可見(jiàn)光度法定量測(cè)定濃度，然后使用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（1 μg RNA，使用20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)結(jié)束后使用雙蒸水稀釋至100 μl備用）。后續(xù)qPCR所用引物序列如下：NFATc1上游：5'-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3'，下游：5'-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3'；ACP5上游：5'-TGTGGCCATCTTTATGCT-3'，下游：5'-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3'；OSCAR 上游：5'-CTGCTGGTAACGGATCAGCTCCCCAGA-3'，下游：5'-CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT-3'；CTSK上游：5'-ACGGAGGCATTGACTCTGAAGATG-3'，下游：5'-GGAAGCACCAACGAGAGGAGAAAT-3'；MMP-9上游：5'-GTCCAGACCAAGGGTACAGC-3'，下游：5'-ATACAGCGGGTACATGAGCG-3'；18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，Rn18s）上游：5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'，下游：5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'。所使用的qPCR反應(yīng)體系為 20 μl（SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，前后鏈引物mix 0.5 μl，ddH2O 7.5 μl），反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min預(yù)變性，隨后95℃10 s變性，65℃30 s擴(kuò)增共循環(huán)40次。分析結(jié)果時(shí)，以Rn18s為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蓽茇酰胺對(duì)BMMs增殖的影響 在蓽茇酰胺處理BMMs 48 h后，10 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組OD450值由對(duì)照組的0.78±0.01降低至0.62±0.02（P＜0.01）；72 h后，5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組OD450值由對(duì)照組的1.30±0.02降低至 1.04±0.04（P＜0.01）；96 h后，5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組OD450值由對(duì)照組的1.84±0.04降低至 1.42±0.06（P＜0.01），見(jiàn)圖1。CCK-8實(shí)驗(yàn)提示，2 μmol/L及以下濃度的蓽茇酰胺對(duì)BMMs增殖無(wú)明顯毒性反應(yīng)。

圖1 蓽茇酰胺對(duì)BMMs增殖的影響（A：不同濃度蓽茇酰胺處理48 h后對(duì)BMMs增殖的影響；B：不同濃度蓽茇酰胺處理72 h后對(duì)BMMs增殖的影響；C：不同濃度蓽茇酰胺處理96 h后對(duì)BMMs增殖的影響）

2.2 蓽茇酰胺對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響 對(duì)照組、0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、2 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組經(jīng)過(guò)6 d培養(yǎng)后，各組孔內(nèi)細(xì)胞經(jīng)固定、TRAP染色，倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)對(duì)照組中出現(xiàn)大量多核、肥大、煎餅樣的成熟破骨細(xì)胞，而在0.5 μmol/L蓽茇酰胺處理下，成熟破骨細(xì)胞數(shù)目顯著下降。與此同時(shí)，1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、2 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中幾乎只有極少量破骨細(xì)胞生成，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中TRAP陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)目≥3個(gè)的破骨細(xì)胞數(shù)目由對(duì)照組的（216.30±13.20）個(gè)降低至（79.00±8.72）個(gè)（P＜0.01），而1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組與2 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（30.67±3.79）個(gè)比（27.00±2.65）個(gè)，P＞0.05]。與此同時(shí)，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中破骨細(xì)胞相對(duì)大小由對(duì)照組的1.00±0.04降低至0.32±0.04（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖2 蓽茇酰胺對(duì)BMMs破骨分化的影響

圖3 蓽茇酰胺對(duì)BMMs破骨分化過(guò)程中細(xì)胞數(shù)目及相對(duì)大小的影響（A：蓽茇酰胺對(duì)成熟破骨細(xì)胞數(shù)目的影響；B：蓽茇酰胺對(duì)破骨細(xì)胞相對(duì)大小的影響）

2.3 蓽茇酰胺對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收能力的影響 對(duì)照組、0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組分別在Osteo Assay Surface骨細(xì)胞表面培養(yǎng)板上進(jìn)行骨吸收實(shí)驗(yàn)后，對(duì)照組中可見(jiàn)大量破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收后形成透亮的骨吸收陷窩，而在0.5 μmol/L蓽茇酰胺處理下骨吸收數(shù)目明顯減少，而在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中幾乎僅有少量的骨吸收陷窩生成，見(jiàn)圖4（插頁(yè)）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組的1.00±0.12比較，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中相對(duì)骨吸收面積降低至0.20±0.03（P＜0.01），而在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中僅為0.04±0.01（P＜0.01），見(jiàn)圖5。2.4 蓽茇酰胺對(duì)BMMs破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子及特征基因mRNA表達(dá)水平的影響 在蓽茇酰胺處理后，與對(duì)照組比較，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組和1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組破骨分化核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和特征基因 ACP5、OSCAR、CTSK、MMP-9 mRNA表達(dá)水平均下調(diào)（均P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖4 蓽茇酰胺對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收能力的影響

圖5 蓽茇酰胺對(duì)破骨細(xì)胞骨相對(duì)骨吸收面積的影響

圖6 蓽茇酰胺對(duì)BMMs破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子及特征基因mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

目前骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防主要為調(diào)整生活方式、補(bǔ)充鈣劑和維生素D，其治療主要集中在抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和（或）促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成。雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑（雷洛昔芬）、雌激素治療、甲狀旁腺素類似物（特立帕肽）及RANKL單抗（狄諾塞麥）等抗骨質(zhì)疏松藥物均有不同的適應(yīng)證、用法、用量、不良反應(yīng)，且部分藥物價(jià)格較高而難以被廣泛應(yīng)用[6-7]。破骨細(xì)胞主要來(lái)自于血系單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，其作為體內(nèi)唯一具有骨吸收作用的終末分化細(xì)胞，在骨發(fā)育、骨塑性、骨折修復(fù)、骨穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。破骨前體細(xì)胞在M-CSF、RANKL刺激下，MAPKs（p38、Erk1/2、JNK）、NF-κB、Akt/Src、PLCγ/Ca2+等大量信號(hào)通路激活，共同促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的活化，這一過(guò)程在破骨細(xì)胞分化、成熟中發(fā)揮著重要作用[8]。破骨細(xì)胞的過(guò)度激活及伴隨骨吸收功能的過(guò)度活化是骨質(zhì)疏松、假體周圍骨溶解、腫瘤骨破壞、廢用性骨丟失等疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的核心致病機(jī)制[9]。臨床上目前廣泛應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥物中，以狄諾塞麥為代表的RANKL單抗可直接靶向抑制RANKL與破骨前體細(xì)胞胞膜上NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）結(jié)合，雙膦酸鹽（如阿侖膦酸、唑來(lái)膦酸等）可通過(guò)骨表面的羥基磷灰石結(jié)合進(jìn)而被破骨細(xì)胞吸收，發(fā)揮抑制其骨吸收活性并促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡的作用[10]。除此以外，大量小分子化合物可直接作用于RANKL/RANK下游信號(hào)通路的活化，發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞分化、減少其骨吸收功能，進(jìn)而緩解骨量丟失[11]。

本研究所聚焦的藥物單體蓽茇酰胺具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和降血脂等藥理作用[4]。其中，蓽茇酰胺可通過(guò)上調(diào)過(guò)氧化物酶 4（peroxiredoxin 4，PRDX4）的表達(dá)促進(jìn)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累積，引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[12]。蓽茇酰胺也可通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平，激活下游抑癌基因p53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic protease，Caspase）依賴性途徑，抑制人胃癌MKN45細(xì)胞增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡[13]。在蓽茇酰胺處理下，三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231遷移和侵襲能力降低，與上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的MMP-2和MMP-9表達(dá)降低，并且可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和SNAI2表達(dá)[14]。本研究顯示2 μmol/L及以下濃度的蓽茇酰胺對(duì)BMMs增殖無(wú)明顯抑制作用，并且TRAP染色提示在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)下幾乎無(wú)成熟破骨細(xì)胞分化，骨吸收能力檢測(cè)表明在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)下破骨細(xì)胞骨吸收能力顯著減弱。在機(jī)制探索層面上，本研究揭示了蓽茇酰胺可濃度依賴性地抑制RANKL刺激下BMMs破骨分化過(guò)程中核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1在mRNA水平的表達(dá)，從而降低下游破骨相關(guān)特征基因ACP5、OSCAR、CTSK、MMP-9的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到抑制破骨分化的作用。BMMs作為破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，可在體外50 ng/ml RANKL、30 ng/ml MCSF等誘導(dǎo)因子的作用下分化成為成熟破骨細(xì)胞。其中RANKL作為破骨細(xì)胞功能維持的重要細(xì)胞因子，發(fā)揮著促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟、抑制其凋亡、增加其骨吸收活性等功能。目前研究已揭示在RANKL刺激下，BMMs細(xì)胞內(nèi)MAPKs、NF-κB、PI3K/Akt等信號(hào)通路出現(xiàn)明顯激活，可導(dǎo)致共同的下游核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的擴(kuò)增，并入核促進(jìn)相關(guān)破骨細(xì)胞特征蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟[15]。近年研究表明，破骨細(xì)胞對(duì)骨基質(zhì)的吸收過(guò)程主要由無(wú)機(jī)成分的溶解和骨基質(zhì)有機(jī)成分的消化所組成。首先，黏附于骨表面的破骨細(xì)胞將氫離子泵入亞破骨細(xì)胞室從而創(chuàng)造一個(gè)酸性微環(huán)境，增加骨礦物質(zhì)的溶解度，導(dǎo)致骨礦物質(zhì)釋放并重新進(jìn)入破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在去除礦物質(zhì)后，膠原酶和明膠酶被分泌到亞破骨細(xì)胞隔室中，進(jìn)一步消化和降解脫鈣骨基質(zhì)的膠原蛋白和其他有機(jī)成分，降解產(chǎn)物最終也被破骨細(xì)胞所吞噬[16]。

綜上所述，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟及骨吸收功能對(duì)機(jī)體病理過(guò)程中骨量丟失的防治意義重大，本研究揭示了蓽茇酰胺對(duì)該過(guò)程的抑制作用。蓽茇酰胺的應(yīng)用，可起到防治破骨細(xì)胞分化過(guò)度或功能活躍所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松、假體周圍骨溶解、腫瘤骨破壞等骨量丟失疾病，但尚需更進(jìn)一步的機(jī)制研究及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證。