促紅細(xì)胞生成素相關(guān)通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的發(fā)病作用機(jī)制研究進(jìn)展

雷敏 胡麗麗 艾明

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的眼部并發(fā)癥，已成為全球主要的致盲原因之一[1]。DR按疾病進(jìn)程分為非增殖性DR（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性DR（proliferative diabetic retinopathy，PDR）兩個(gè)階段[2]。2021年國際糖尿病聯(lián)合會(huì)糖尿病流行病學(xué)報(bào)告指出，近50多年來全球糖尿病的患病率呈持續(xù)上升趨勢，預(yù)計(jì)到2030年將上升至10.2%[3]。《中國老年糖尿病診療指南》（2021年版）指出，2019年中國65歲以上糖尿病患者數(shù)約3 550萬，居世界首位，占全球老年糖尿病患者的1/4[4]。研究顯示，視網(wǎng)膜屏障的破壞、視網(wǎng)膜新生血管形成及視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變在DR進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，其發(fā)病機(jī)制涉及多種調(diào)控機(jī)制和通路[5]。近年來，臨床針對DR的治療主要有抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物和皮質(zhì)類固醇藥物的玻璃體腔內(nèi)注射、視網(wǎng)膜激光光凝和后入路玻璃體切除手術(shù)[6]，但仍然存在部分患者治療效果不佳及視力預(yù)后不理想的情況。研究已證實(shí)，在DR發(fā)展早期，促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）具有明顯的血管神經(jīng)保護(hù)作用[7]，PDR患者血清中EPO水平明顯升高，且EPO水平與PDR臨床分期呈正相關(guān)[8-9]。本文就EPO相關(guān)通路在DR中的發(fā)病作用機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述。

1 EPO及其與DR的關(guān)系

EPO是一種由4個(gè)α螺旋束組成的糖基化細(xì)胞因子，屬于集落刺激因子。胚胎期由胎兒肝臟產(chǎn)生，出生后主要由腎臟產(chǎn)生[10]。EPO在人體組織中廣泛分布，對心臟、胃腸道、肌肉、腎臟、胰腺和神經(jīng)組織等有直接影響，可靶向作用紅細(xì)胞、類紅細(xì)胞及其祖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等[11]。EPO是一把雙刃劍，近年來研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下EPO對視網(wǎng)膜神經(jīng)元、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞和Mller細(xì)胞具有保護(hù)功能[12]。EPO通過與EPO受體（erythropoietin receptor，EPOR）的相互結(jié)合發(fā)揮作用，有研究表明EPOR在PDR患者玻璃體中的表達(dá)水平越高預(yù)后越差，故EPOR有望作為PDR的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)EPO既參與視網(wǎng)膜的生理性血管生成，又參與病理性血管生成[11]。研究已證實(shí)，在DR發(fā)展早期，EPO具有明顯的血管神經(jīng)保護(hù)作用[7]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)，EPO通過抑制甲基乙二醛的形成來降低血管生成素2（angiogenin-2，Ang-2）的表達(dá)，從而減少視網(wǎng)膜周細(xì)胞的絲氨酸-蘇氨酸激酶磷酸化，進(jìn)而抑制周細(xì)胞遷移和凋亡，預(yù)防DR早期微血管損傷，在DR早期發(fā)揮保護(hù)作用。Gu等[16]發(fā)現(xiàn)EPO主要通過維持谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關(guān)蛋白的正常表達(dá)，抑制高糖條件下凋亡誘導(dǎo)因子易位和聚腺苷-核糖聚合物形成，下調(diào)谷氨酸受體，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)元過度興奮和神經(jīng)元毒性，減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡，來實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。Bretz等[17]發(fā)現(xiàn)EPOR基因敲除小鼠視網(wǎng)膜的內(nèi)層和外層網(wǎng)狀層更薄，異位神經(jīng)突起和b波更低，進(jìn)一步證實(shí)了EPO的血管神經(jīng)保護(hù)作用。另外研究顯示，生理狀態(tài)下玻璃體中EPO水平是血漿中的3.5倍，DR患者玻璃體EPO水平比血漿高30倍，比非糖尿病患者玻璃體內(nèi)EPO高10倍[18]。PDR患者血清中EPO水平明顯升高，且EPO水平與PDR臨床分期呈正相關(guān)[8-9]。有學(xué)者提出，EPO具有類似于VEGF的促血管形成活性，能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[19-20]。進(jìn)一步證實(shí)，PDR患者玻璃體中EPO與VEGF明顯增高，兩者具有并聯(lián)協(xié)調(diào)作用，它們呈正函數(shù)相關(guān)[20]，提示EPO可加劇PDR視網(wǎng)膜缺血和新生血管生成，從而加速PDR的進(jìn)展。

2 EPO對NPDR患者視網(wǎng)膜的保護(hù)作用機(jī)制

2.1 磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信號通路PI3K/Akt信號通路可調(diào)節(jié)血管生成因子、促炎因子的表達(dá)及相關(guān)細(xì)胞的功能，參與多種酶生物學(xué)效應(yīng)，介導(dǎo)正常血管及病理性血管的形成[21]。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者中血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障（inner blood-retinal barrier，iBRB）完整性的破壞是通過VEGF/血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2）/絡(luò)氨酸蛋白激酶（sarcoma，Src）信號通路磷酸化水平增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）表達(dá)的降低誘導(dǎo)的，EPO可通過抑制VEGF/VEGFR2/Src信號通路，促進(jìn)DR大鼠VE-cadherin的表達(dá)從而維持視網(wǎng)膜的屏障功能，發(fā)揮DR早期血管保護(hù)作用。Xie等[12]發(fā)現(xiàn)，DR大鼠視網(wǎng)膜中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致脫細(xì)胞毛細(xì)血管形成，引起血管滲漏，而EPO可以提高Src/Akt/肌動(dòng)蛋白素（cofilin）信號通路相關(guān)分子 Src、Akt、cofilin的磷酸化比例，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能，從而保護(hù)iBRB，抑制血管滲漏。先前研究已證實(shí)缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵下游蛋白，通過誘導(dǎo)下游蛋白質(zhì)EPO的表達(dá)來阻止高糖環(huán)境下血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的破壞，同時(shí)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)，從而保護(hù)細(xì)胞免受缺氧損傷，抑制血管生成[23-24]。另外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EPO還可通過抑制HIF-1α/VEGF信號通路，保持iBRB的完整性并減弱血管滲漏[25-26]。適量的EPO可以選擇性下調(diào)IL-1β、TNF-α、IL-6、VEGF等炎癥相關(guān)因子，可保護(hù)實(shí)驗(yàn)性DR模型BRB完整性[27]。

2.2 氧化應(yīng)激通路核因子相關(guān)因子2（NF-E2-related factor，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號通路 Nrf2/ARE信號通路是一種普遍存在的、進(jìn)化保守的信號通路[28-29]。Nrf2作為氧化應(yīng)激的感受器，在抗氧化應(yīng)激中起重要作用[30]。Nrf2對氧化應(yīng)激高度敏感，可特異性識別并結(jié)合ARE，促進(jìn)相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，激活血紅素氧化酶（heme oxidase，HO-1）和醌氧化還原酶（quinone oxidoreductases，NQO-1），清除多余的氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷[31]。研究發(fā)現(xiàn)，EPO可過通過影響實(shí)驗(yàn)性DR大鼠氧化應(yīng)激通路相關(guān)分子，提高Nrf2、HO-1和NQO-1的表達(dá)水平，減少超氧化物和其他自由基產(chǎn)生，下調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶，降低磷酸化Akt和熱休克蛋白水平，降低視網(wǎng)膜Ang-2表達(dá)，減少靶細(xì)胞氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激，從而減少DR神經(jīng)細(xì)胞損傷以及周細(xì)胞的凋亡[32]。

2.3 非受體型絡(luò)氨酸蛋白激酶（non-receptor tyrosine protein kinases，JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）信號通路 JAK/STAT信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用[33]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)JAK通路后可以有效促進(jìn)EPO引起的RPE胞質(zhì)Ca2+內(nèi)流，從而維持BRB的穩(wěn)定[34]。EPO通過抑制參與JAK/STAT信號通路的分子，包括重組人B細(xì)胞淋巴瘤因子2XL（recombinant human B-cell leukemia/lymphoma XL，Bcl-xL）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic protease，Caspase）-3、Caspase-9、蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase type 2A，PP2A）、抑癌基因p53、磷酸酶基因（phosphatase gene，PTEN）和沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator 1，SIRT1）等，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮血管神經(jīng)保護(hù)作用，延緩早期DR進(jìn)展[11,35]。Wang等[36]發(fā)現(xiàn)，EPO能有效抑制高糖介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGC）中Caspase-9和Caspase-3的上調(diào)，降低Bax/Bcl-2比值，從而抑制RGC的凋亡。

2.4 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路 ERK信號通路是細(xì)胞生物學(xué)中研究最多的信號通路之一[37]，控制著許多重要的細(xì)胞生物學(xué)過程。既往研究證實(shí)，表皮生長因子通過與其受體結(jié)合后激活腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）/絲裂原活化蛋白激酶-胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinase-extracellular signal-regulated kinase，MEK），激活的 MEK 使ERK磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核影響基因轉(zhuǎn)錄翻譯[38]。免疫組化分析證實(shí)，DR早期缺氧環(huán)境下VEGF可激活ERK的磷酸化，細(xì)胞中磷酸化ERK-1/2與總ERK-1/2的比值顯著降低，調(diào)節(jié)血管通透性和細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新生血管形成，而EPO可通過逆轉(zhuǎn)這一比值發(fā)揮其血管保護(hù)作用[39]。Shen等[40]發(fā)現(xiàn)，EPO可能通過ERK通路下調(diào)Bax，上調(diào)Bcl-2相關(guān)死亡促進(jìn)因子磷酸化和Bcl-xL表達(dá)，發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用。鋅是人體中第二豐富的微量元素，在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、RPE和脈絡(luò)膜中廣泛存在，參與視網(wǎng)膜的多種功能，在視網(wǎng)膜生理和病理過程中起著重要作用，如光傳導(dǎo)、視覺周期和神經(jīng)傳導(dǎo)等[41]。ZnT8作為鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，可將細(xì)胞內(nèi)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，在調(diào)節(jié)細(xì)胞鋅穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。Xu等[39]研究表明，EPO通過激活ERK通路上調(diào)ZnT8的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)鋅的穩(wěn)態(tài)，保護(hù)高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜細(xì)胞免受過量鋅引起的損傷，提高細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡。

2.5 氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路 JNK蛋白是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的成員，由 MAPK8、MAPK9和MAPK10 3個(gè)基因編碼，此信號通路調(diào)控多種生理過程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡等[42-43]。JNK信號通路由多種細(xì)胞內(nèi)外刺激（如細(xì)胞因子、病原體、激素、氧化應(yīng)激、DNA損傷等）激活，它們可使多種細(xì)胞質(zhì)和核底物發(fā)生磷酸化，如MAPK3的磷酸化[44]。Qi等[45]通過用EPO干預(yù)敲除酪氨酸蛋白磷酸酶非受體1型（tyrosine protein phosphatase nonreceptor 1，PTPN1）和 PTPN11基因編碼的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，EPO可通過提高PTPN1和PTPN11的表達(dá)水平來抑制JNK信號通路，從而顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的RGC凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Zhang等[46]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EPO通過阻斷缺氧誘導(dǎo)JNK的磷酸化，上調(diào)緊密連接蛋白和閉合蛋白的表達(dá)，保護(hù)BRB，從而減少血管滲漏，延緩DR進(jìn)展。

3 EPO在PDR中的發(fā)病作用機(jī)制

Samson等[35]研究顯示，轉(zhuǎn)染EPOsiRNA的RPE細(xì)胞中VEGF表達(dá)下調(diào)。視網(wǎng)膜缺氧且VEGF高表達(dá)是PDR的主要誘導(dǎo)因素，EPO可增強(qiáng)VEGF的作用，從而促進(jìn)新生血管形成，使PDR進(jìn)一步惡化[34，47]。Gholamhossein等[48]和He等[13]發(fā)現(xiàn)，PDR患者血漿EPO水平明顯高于NPDR患者，EPO水平與DR分期相關(guān)，同時(shí)PDR患者視網(wǎng)膜增殖膜中EPOR表達(dá)顯著高于視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者，且PDR患者術(shù)后最佳矯正視力與EPOR表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示EPO與PDR患者的預(yù)后相關(guān)。

4 EPO的相關(guān)應(yīng)用

目前，基于靶向EPO的相關(guān)應(yīng)用仍處于實(shí)驗(yàn)階段，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下注射腺相關(guān)病毒介導(dǎo)表達(dá)人源EPO（AAV2-CMV-hEPO）的基因，可使血清中具有生物活性的EPO蛋白增加，從而發(fā)揮其血管神經(jīng)保護(hù)作用[49]。EPO衍生的肽ARA290[50]、氨甲?；疎PO（CEPO）[47]通過抑制RGC及小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和延緩血管退行性病變，使實(shí)驗(yàn)性DR大鼠的視網(wǎng)膜電圖b波振幅和振蕩電位下降，從而發(fā)揮血管神經(jīng)保護(hù)作用。Li等[51]通過對5例DR患者行EPO玻璃體腔注射，發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)療效可觀，但存在樣本量較少的局限性。因此，攜帶EPO基因或其他特定基因的AAV2載體有望成為DR長期預(yù)防或輔助治療的潛在治療方式，但EPO在DR中的臨床應(yīng)用仍然需要大量的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

5 小結(jié)

DR是糖尿病的常見并發(fā)癥，可引起不可逆的視網(wǎng)膜損傷。EPO作為一種糖基化細(xì)胞因子，在DR發(fā)展早期具有明顯的血管神經(jīng)保護(hù)作用。在PDR中，可導(dǎo)致病理性血管的生成以及BRB的破壞，加劇PDR的進(jìn)展。在DR發(fā)病機(jī)制中EPO所參與的各種信號通路并不是孤立存在的，往往存在多個(gè)信號通路間的協(xié)同作用。近年來，針對DR雖然有非常成熟的治療方式，如抗VEGF藥物和皮質(zhì)類固醇藥物玻璃體腔注射、視網(wǎng)膜激光光凝、玻璃體切除術(shù)等，但仍然存在大部分DR患者出現(xiàn)治療效果不佳以及預(yù)后不理想的情況。DR發(fā)病機(jī)制中EPO相關(guān)信號通路的不斷探索為DR的治療提供了更多潛在的靶點(diǎn)，這些發(fā)現(xiàn)對延緩DR進(jìn)展以及治療具有非常重要的臨床意義。