下調miR-106a-5p對過氧化氫誘導的心肌細胞損傷及JAK1/STAT3通路的影響

姜花，沈延梅，馬馴凱

近年來，心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢［1］。心肌細胞是一種高度分化的細胞，其過度凋亡會導致心臟功能減退，最終導致心血管疾病發(fā)生。研究表明，氧化應激反應導致的氧自由基增多可誘導心肌細胞凋亡，在缺血性心臟病、冠心病、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［2-4］。因此，降低氧化應激反應水平、減少心肌細胞凋亡對治療心血管疾病具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種在機體內廣泛存在的非編碼內源性小分子RNA，參與細胞增殖、凋亡等多種生物學行為，與包括心血管疾病在內的多種疾病的進展密切相關［5］。有研究表明，miR-106a-5p在慢性心力衰竭患者血漿中顯著上調［6］，但其在心血管疾病氧化應激損傷中的作用鮮有研究。Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路是細胞因子信號傳導的重要途徑，參與調控細胞增殖、凋亡等多種細胞功能及氧化應激、炎癥、腫瘤等多種病理過程，近年來其在心血管疾病中的作用備受重視［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制JAK1/STAT3通路可改善心肌梗死大鼠心肌受損情況，從而保護心功能［9］。本研究旨在觀察下調miR-106a-5p對過氧化氫（H2O2）誘導的心肌細胞損傷及JAK1/STAT3通路的影響，以期為治療氧化應激引起的心血管疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠心肌H9c2細胞（貨號：HZR007）購自美國ATCC；DMEM高糖培養(yǎng)基、逆轉錄試劑盒、CCK-8試劑、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒（貨號：ZY-97076、ZY1011R、ZY2701M、ZYS0185、ZY-4712-1）購自上海澤葉生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malonydialdehyed，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（貨號：xy-E12190、xy-E12430、xy-E12431）購自上海信裕生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑（貨號：11668-019）購自美國Invitrogen；miR-106a-5p NC、miR-106a-5p siRNA及U6、miR-106a-5p引物購自上海碧云天生物技術有限公司；SYBR Green qRT-PCR Kit（貨號：CD-13505-ML）購自武漢純度生物科技有限公司；兔源一抗p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3、GAPDH及羊抗兔二抗（貨號：db2764、db9826、db2536、db1650、db7662、db10002）購自杭州戴格生物技術有限公司。NAPCO-8800型培養(yǎng)箱購自美國Shellab公司；Lightcycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀購自德國Roche公司；Stat Fax-2100型酶標儀購自美國Awareness公司；GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 使用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素溶液）培養(yǎng)凍存復蘇后H9c2細胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，當細胞長至85%~90%時，用0.25%胰蛋白酶消化至細胞變圓，更換新鮮培養(yǎng)基，按比例1∶3進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組 將傳代2次后的對數(shù)生長期H9c2細胞用培養(yǎng)基調整為1×104個/mL的單細胞懸液，接種至96孔或12孔細胞培養(yǎng)板，將細胞分為對照組和H2O2處理組（50、100、200、400μmol/L），檢測細胞增殖；另將細胞分為對照組、H2O2組（100μmol/L H2O2）、miR-106a-5p NC組（100μmol/L H2O2+轉染4μg miR-106a-5p NC）和miR-106a-5p siRNA組（100μmol/L H2O2+轉染4μg miR-106a-5p siRNA），檢測細胞增殖、凋亡及miR-106a-5p、氧化應激相關因子、JAK1/STAT3通路相關蛋白表達。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測miR-106a-5p表達 細胞給予相應處理后培養(yǎng)48 h，使用TRIzol法提取細胞中總RNA，測定RNA樣品濃度、純度合格后分裝，-80℃保存。取RNA樣品，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。取cDNA樣本，使用試劑盒配制qPCR反應體系，在熒光定量PCR儀上進行擴增。20μL反應體系：SYBR premix 11μL，PCR上、下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O 7μL。反應條件：95℃5 min；95℃12 s，57℃30 s，40個循環(huán)。以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-106a-5p相對表達水平。miR-106a-5p上游引物5′-ATCCAGTGCTGTCGTG-3′，下游引物5′-TGCTAAAAGTGCTTACAGTG-3′；U6上游引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下 游 引 物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 細胞給予相應處理后培養(yǎng)48 h，更換新培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10μL，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標儀于波長450 nm處檢測光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率=（OD對照組-OD實驗組）/OD對照組×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞給予相應處理后培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，加入結合緩沖液重懸為1×106個/mL，每孔添加Annexin V-FITC試劑5μL、PI試劑5μL混勻，避光孵育1 h，使用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.2.6 試劑盒檢測氧化應激相關因子表達 細胞給予相應處理后培養(yǎng)48 h，分離細胞培養(yǎng)液及細胞。使用試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中LDH含量及GSH-Px活性。向細胞中加入RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，收集細胞上清液，BCA法測定總蛋白含量，使用試劑盒測定MDA含量及SOD活性。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測細胞中JAK1/STAT3通路相關蛋白表達 細胞給予相應處理后培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，加入RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，收集細胞上清液，BCA法測定總蛋白含量。取60μg蛋白樣品95℃處理變性，上樣至10%SDS-PAGE分離膠進行電泳分離、轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后加1∶1 000稀釋的一抗（兔抗p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3、GAPDH）孵育過夜，再次洗膜，加1∶2 000稀釋的羊抗兔二抗室溫孵育2 h再次洗膜，ECL試劑顯色，凝膠掃描成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH蛋白為內參蛋白分析目的蛋白條帶相對灰度。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度H2O2對H9c2細胞增殖的影響 對照組以及50、100、200、400μmol/L H2O2處理組H9c2細胞增殖抑制率（%）分別為0.00±0.00、17.56±1.22、33.28±1.54、48.08±2.86、62.83±3.72。與 對 照 組 相比，各個濃度H2O2處理組H9c2細胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05）。其中，100μmol/L H2O2接近30%細胞生長抑制濃度（30% growth inhibitory concentration，IC30），選擇該濃度用于后續(xù)實驗。

2.2 各組H9c2細胞中miR-106a-5p表達水平、增殖抑制率及凋亡情況 與對照組相比，H2O2組H9c2細胞miR-106a-5p表達水平、增殖抑制率及凋亡率顯著升高（P＜0.05）；H2O2組與miR-106a-5p NC組H9c2細胞中miR-106a-5p表達水平、增殖抑制率及凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與miR-106a-5p NC組相比，miR-106a-5p siRNA組H9c2細胞miR-106a-5p表達水平、增殖抑制率及凋亡率顯著降低（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of miR-106a-5p expression level,proliferation inhibition rate and apoptosis rate between the four groups of H9c2 cells表1 各組H9c2細胞中miR-106a-5p表達水平、增殖抑制率及凋亡率比較 （n=6）

Tab.1 Comparison of miR-106a-5p expression level,proliferation inhibition rate and apoptosis rate between the four groups of H9c2 cells表1 各組H9c2細胞中miR-106a-5p表達水平、增殖抑制率及凋亡率比較 （n=6）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與H2O2組比較，c與miR-106a-5p NC組比較，P＜0.05。

組別對照組H2O2組miR-106a-5p NC組miR-106a-5p siRNA組F miR-106a-5p 1.00±0.00 1.64±0.12a 1.66±0.12a 0.85±0.10bc 110.737＊＊增殖抑制率（%）0.00±0.00 32.95±1.58a 33.54±1.43a 14.30±1.05abc 1 110.412＊＊凋亡率（%）5.62±0.52 35.08±1.63a 34.55±1.56a 17.26±1.04abc 762.780＊＊

2.3 各組H9c2細胞培養(yǎng)液LDH含量、GSH-Px活性及細胞中MDA含量、SOD活性情況 與對照組相比，H2O2組H9c2細胞培養(yǎng)液LDH含量及細胞中MDA含量顯著升高（P＜0.05），細胞培養(yǎng)液GSH-Px活性及細胞中SOD活性顯著降低（P＜0.05）；H2O2組與miR-106a-5p NC組H9c2細胞培養(yǎng)液LDH含量、GSH-Px活性及細胞中MDA含量、SOD活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與miR-106a-5p NC組相比，miR-106a-5p siRNA組H9c2細胞培養(yǎng)液LDH含量及細胞中MDA含量顯著降低（P＜0.05），細胞培養(yǎng)液GSH-Px活性及細胞中SOD活性顯著升高（P＜0.05），見表2。

Fig.1 Apoptosis of H9c2 cells in each group圖1 各組H9c2細胞凋亡情況

Tab.2 Comparison of LDH content,GSH-Px activity,MDA content and SOD activity in H9c2 cell culture medium between the four groups表2各組H9c2細胞培養(yǎng)液LDH含量、GSH-Px活性及細胞中MDA含量、SOD活性比較 （n=6，x±s）

2.4 各組H9c2細胞中JAK1/STAT3通路相關蛋白表達情況 與對照組相比，H2O2組H9c2細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3顯著升高（P＜0.05）；H2O2組與miR-106a-5p NC組H9c2細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與miR-106a-5p NC組相比，miR-106a-5p siRNA組H9c2細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3顯著降低（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Protein expressions of p-JAK1,JAK1,p-STAT3 and STAT3 in H9c2 cells of each group圖2 各組H9c2細胞中p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表達情況

Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-JAK1/JAK1 and p-STAT3/STAT3 between the four groups of H9c2 cells表3各組H9c2細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平比較 （n=6，）

Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-JAK1/JAK1 and p-STAT3/STAT3 between the four groups of H9c2 cells表3各組H9c2細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與H2O2組比較，c與miR-106a-5p NC組比較，P＜0.05。

組別對照組H2O2組miR-106a-5p NC組miR-106a-5p siRNA組F p-JAK1/JAK1 0.30±0.04 0.84±0.07a 0.81±0.07a 0.52±0.06abc 105.000＊＊p-STAT3/STAT3 0.34±0.05 0.89±0.08a 0.87±0.07a 0.50±0.07abc 96.086＊＊

3 討論

心肌損傷是多種心血管疾病的病理基礎，而心肌細胞凋亡是其發(fā)生的主要過程之一。研究顯示，治療心血管疾病時，心肌缺血-再灌注過程會促使心肌細胞產生大量的氧自由基，增強氧化應激反應，破壞細胞膜結構，最終誘導心肌細胞凋亡［10］。H2O2是重要的氧化反應分子，參與調控細胞增殖、基因表達，具有易穿膜、價格低廉及性質穩(wěn)定等特點，一般用作體外構建氧化應激細胞模型的誘導劑［11］。大鼠H9c2心肌細胞易培養(yǎng)，進行實驗可重復性強且批間差異小，近年來常應用于心血管領域研究［12］。本研究設置H2O2濃度梯度處理大鼠心肌細胞H9c2，最后選擇最接近IC30的100μmol/L用于構建氧化應激H9c2細胞模型。MDA是過氧化產物之一，可反映細胞內脂質過氧化程度及氧化應激程度；LDH在細胞受到氧自由基攻擊產生損傷時會從細胞內釋放出來，可反映心肌細胞膜受損程度及氧化應激程度；GSH-Px、SOD在生理下可清除細胞內外的氧自由基，減輕細胞損傷程度，發(fā)揮抗氧化應激作用［13-15］。本研究結果顯示，與對照組相比，H2O2組H9c2細胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高，細胞培養(yǎng)液LDH含量及細胞中MDA含量顯著升高，細胞培養(yǎng)液GSHPx活性及細胞中SOD活性顯著降低，提示H2O2可促進氧化應激反應，抑制抗氧化應激反應，抑制H9c2細胞增殖并誘導細胞凋亡。

近年來，隨著對非編碼RNA研究的深入，miRNAs在心血管疾病及心肌細胞凋亡中發(fā)揮的作用越來越受到關注。miR-92a、miR-29b、miR-495-3p等均已被發(fā)現(xiàn)與H2O2誘導的心肌細胞凋亡有關［16-18］。李璐等［6］分析慢性心力衰竭患者血漿中miRNA表達譜發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p表達水平在慢性心力衰竭患者血漿中顯著上調。本研究結果顯示，與對照組相比，H2O2組H9c2細胞中miR-106a-5p表達水平顯著升高，提示miR-106a-5p在H2O2誘導的氧化應激損傷H9c2細胞中高表達。而下調miR-106a-5p表達后，H2O2誘導的H9c2細胞增殖抑制率、凋亡率顯著降低，同時細胞培養(yǎng)液LDH含量及細胞中MDA含量顯著降低，細胞培養(yǎng)液GSH-Px活性及細胞中SOD活性顯著升高，提示下調miR-106a-5p可提高抗氧化應激能力，減輕氧化應激，抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡，發(fā)揮抗心肌細胞氧化應激損傷的作用。

JAK/STAT通路是一種應激反應途徑，將信號由細胞表面?zhèn)鬟f至細胞核，進而調節(jié)基因表達。其中，JAK1/STAT3信號通路在心血管疾病中發(fā)揮的作用至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，短暫性心肌缺血/再灌注可激活JAK1，從而激活下游STAT3通路，抑制JAK/STAT通路激活可減輕心肌細胞凋亡引起的組織損傷［19］。張靜等［20］研究亦顯示，苦參提取物能減輕缺血再灌注大鼠心肌損傷，可能與抑制JAK/STAT信號通路成員JAK2、STAT1、STAT3激活有關。本研究結果顯示，H2O2組H9c2細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3較對照組顯著升高，提示H2O2可激活H9c2細胞中的JAK1/STAT3信號通路。下調miR-106a-5p表達后，H2O2誘導的H9c2細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平顯著降低，提示下調miR-106a-5p表達可抑制JAK1/STAT3信號通路激活，推測H2O2激活H9c2細胞中的JAK1/STAT3信號通路可能與miR-106a-5p水平升高有關。

綜上所述，下調miR-106a-5p表達可抑制JAK1/STAT3信號通路激活，調節(jié)氧化應激/抗氧化應激平衡，減輕H2O2誘導的H9c2細胞凋亡，本研究可能為防治氧化應激引起的心血管疾病提供一定參考。