阿爾茨海默病患者血清GGT、CTHRC1表達(dá)水平檢測及臨床意義

陳俊，鄭錦豪，陳家良，陳博

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是癡呆癥的最常見的類型，截至2016年全球患病例數(shù)達(dá)4 700萬，且其發(fā)病率有不斷升高的趨勢［1］。AD的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，通常認(rèn)為與細(xì)胞外淀粉樣斑塊沉積、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等有關(guān)。雖然近年來磁共振成像等影像技術(shù)能對沉積的β淀粉樣肽（amyloid-beta protein，Aβ）和tau蛋白進(jìn)行分子成像，有助于AD的早期診斷及療效評估，但價格昂貴，臨床難以普及［2］。因此，尋找具有較高特異性的AD血清標(biāo)志物具有重要的臨床意義。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）是一種I型γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，可催化谷胱甘肽的谷氨酰部分轉(zhuǎn)移至多種氨基酸和二肽受體，參與神經(jīng)遞質(zhì)代謝、一氧化氮信號傳導(dǎo)和氧化應(yīng)激等過程的調(diào)節(jié)［3］。氧化應(yīng)激損傷是AD發(fā)病的重要影響因素，GGT在AD疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，有望成為一種新的生物標(biāo)志物［4］。膠原蛋白三螺旋重復(fù)蛋白1（collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）基因位于8號染色體，分子質(zhì)量為30 ku，其作為一種分泌型蛋白，廣泛參與形態(tài)發(fā)生、血管重塑等病理、生理過程［5］。近年來有研究利用高通量蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，CTHRC1在AD患者腦脊液中表達(dá)顯著升高，可能是早期診斷AD新的標(biāo)志物［6］。本研究旨在通過檢測AD患者血清GGT和CTHRC1表達(dá)水平，探討兩者的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年1月—2022年1月于湖北省中醫(yī)院腦病科及浙江省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)內(nèi)科住院部診治的120例AD患者為研究對象（AD組），AD診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國醫(yī)師協(xié)會2018年制定的《中國癡呆與認(rèn)知功能障礙診治指南》。男70例，女50例，年齡62～84歲，平均（74.08±7.19）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）平均（22.43±2.04）kg/m2；病程1～6年，平均（1.79±0.52）年；受教育年限平均（6.81±2.65）年；高血壓史45例；糖尿病史33例；吸煙史（＞20包/年）34例。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、精神障礙性疾病等；伴顱腦外傷或腦卒中等疾病引起的認(rèn)知功能損害；伴有急性感染性疾病、骨代謝性疾病等；合并肝炎、肝硬化等肝膽系統(tǒng)疾病。選取同期于湖北省中醫(yī)院體檢者60例為對照組，男33例，女27例，年齡63~82歲，平均（73.51±6.46）歲；BMI平均（22.01±2.15）kg/m2；受教育年限平均（7.01±2.79）年；高血壓史18例；糖尿病史15例；吸煙史19例；均無腦卒中、帕金森病、AD等疾病病史。2組性別（χ2=0.182）、年齡（t=0.518）、BMI（t=1.279）、受教育年限（t=0.469）、高血壓史（χ2=0.989）、糖尿病史（χ2=0.128）及吸煙史（χ2=0.214）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)通過（倫理號：M201908011），患者家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標(biāo) 收集所有研究對象的性別、年齡、BMI、吸煙史、高血壓史、糖尿病史及受教育年限等一般資料。收集AD組患者入組后第1天和對照組健康查體時實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.2.2 血清GGT、CTHRC1及炎性因子水平檢測 所有研究對象于清晨空腹采集靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min，取上層血清待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血清GGT、CTHRC1及炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6水平。GGT ELISA試劑盒購自上海齊泰生物公司（貨號QT13290），CTHRC1 ELISA試劑盒購自上海瑞番生物公司（貨號RF1214），TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技公司。采用免疫比濁法檢測血清超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照實(shí)際和說明書進(jìn)行。

1.2.3 認(rèn)知功能評估 2組均采用簡易智能精神狀態(tài)檢查量表（mini-mental state examination，MMSE）評估認(rèn)知功能障礙程度［7］，評估內(nèi)容包括記憶、定向、計(jì)算、注意、語言和視空間各項(xiàng)能力，總評分范圍0～30分，得分越低，患者認(rèn)知功能障礙程度越嚴(yán)重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。受試者工作特征（ROC）曲線分析血清GGT、CTHRC1單獨(dú)及聯(lián)合檢測對AD的診斷價值。利用R語言3.6.3版本中Delong檢驗(yàn)比較各指標(biāo)診斷AD的診斷效能差異。多因素Logistic回歸分析影響AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血脂和膽固醇水平比較 2組TC、TG、HDL-C及LDL-C差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 2組患者血清GGT、CTHRC1、炎性因子及MMSE評分比較 與對照組比較，AD組血清GGT、CTHRC1、TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP水平升高，而MMSE評分降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of blood lipid and cholesterol levels between the two groups表1 2組血脂和膽固醇水平比較（mmol/L）

Tab.1 Comparison of blood lipid and cholesterol levels between the two groups表1 2組血脂和膽固醇水平比較（mmol/L）

均P＞0.05。

組別對照組AD組t或χ2 n 60 120 TC 3.93±0.41 4.05±0.46 1.709 TG 1.42±0.31 1.46±0.30 0.834 HDL-C 0.98±0.15 1.01±0.17 1.159 LDL-C 2.73±0.36 2.81±0.38 1.355

Tab.2 Comparison of serum levels of GGT,CTHRC1 and inflammatory factors between the two groups of patients表2各組血清GGT，CTHRC1及炎癥因子水平比較

Tab.2 Comparison of serum levels of GGT,CTHRC1 and inflammatory factors between the two groups of patients表2各組血清GGT，CTHRC1及炎癥因子水平比較

＊＊P＜0.01。

組別對照組AD組t n 60 120 GGT（U/L）23.87±6.09 47.14±7.92 19.985＊＊CTHRC1（μg/L）32.73±5.64 43.27±6.42 10.800＊＊TNF-α（ng/L）147.35±13.12 196.27±12.42 24.446＊＊組別對照組AD組t IL-6（ng/L）61.34±11.54 106.34±13.27 22.370＊＊IL-1β（ng/L）28.29±6.28 38.34±7.14 9.256＊＊hs-CRP（ng/L）1.91±0.73 5.08±0.62 30.446＊＊MMSE評分（分）28.34±1.04 15.66±3.22 29.702＊＊

2.3 AD患者血清GGT、CTHRC1表達(dá)與炎癥因子、MMSE評分的相關(guān)性 AD組患者血清GGT、CTHRC1表達(dá)與TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP水平呈正相關(guān)，與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Correlation of serum GGT and CTHRC1 expression with inflammatory factors and MMSE score in the AD group表3 AD組血清GGT、CTHRC1表達(dá)與炎癥因子、MMSE評分的相關(guān)性 （r）

2.4 影響AD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 以是否發(fā)生AD（是=1，否=0）為因變量，以TNF-α、IL-6、IL-1β、hs-CRP、GGT、CTHRC1及MMSE評分為自變量，Logistic回歸分析顯示，較高水平GGT、CTHRC1是影響AD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而較高M(jìn)MSE評分是影響AD發(fā)生的保護(hù)因素（P＜0.05），見表4。

2.5 血清GGT和CTHRC1單獨(dú)及聯(lián)合檢測對AD的診斷價值 血清GGT、CTHRC1聯(lián)合檢測概率方程為：Log（P/1-P）=-1.754+0.251×GGT+0.298×CTHRC1。兩者聯(lián)合診斷效能優(yōu)于GGT或CTHRC1單一指標(biāo)（Z分別為4.370和5.657，P＜0.05），見表5、圖1。

Tab.4 Multivariate Logistic regression analysis on the occurrence of AD表4 影響AD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

Tab.5 Diagnostic value of serum GGT and CTHRC1 alone and in combination for AD表5血清GGT，CTHRC1單獨(dú)及聯(lián)合檢測對AD的診斷價值

Fig.1 ROC curve analysis of the diagnostic value of serum GGT,CTHRC1 alone and combined detection in AD圖1 ROC曲線分析血清GGT，CTHRC1單獨(dú)及聯(lián)合檢測對AD的診斷價值

3 討論

AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。遺傳代謝研究表明，Aβ肽的積累是AD發(fā)生、發(fā)展過程中的早期事件，Aβ肽能夠誘導(dǎo)組織細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，造成氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，大量活性氧在造成神經(jīng)細(xì)胞膜、蛋白及DNA損傷的同時還能激活機(jī)體免疫細(xì)胞，釋放TNF-α、IL-6及IL-1β等大量促炎細(xì)胞因子，引起嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥反應(yīng)［8］。神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙、記憶力下降，當(dāng)疾病進(jìn)展時可出現(xiàn)較嚴(yán)重的神經(jīng)精神癥狀，最終導(dǎo)致患者死亡［9］。因此，深入研究AD發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找影響氧化應(yīng)激過程的關(guān)鍵分子標(biāo)志物，有助于AD早期診治。

GGT是細(xì)胞內(nèi)一種促氧化應(yīng)激的因子，是氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物，參與細(xì)胞內(nèi)抗氧化因子谷胱甘肽攝取和其細(xì)胞外的分解代謝過程［10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外周血中活性氧水平升高會導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和損傷，且其水平升高與血管性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切［11］。本研究結(jié)果顯示，AD患者血清GGT水平較體檢健康者升高，并且與炎性因子TNFα、IL-6、IL-1β及hs-CRP呈正相關(guān)，提示GGT可能通過促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)AD的疾病進(jìn)展，考慮可能原因?yàn)镚GT能夠降解細(xì)胞外谷胱甘肽，導(dǎo)致機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，產(chǎn)生過量TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥損傷［12］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，GGT表達(dá)水平升高可通過影響鐵蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致腦內(nèi)鐵超載，促進(jìn)AD患者疾病進(jìn)展［13］。本研究中，AD患者血清GGT水平與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)，提示血清GGT水平有助于反映AD患者認(rèn)知障礙的程度，考慮原因可能為GGT的表達(dá)升高引起氧自由基的積累，導(dǎo)致大腦中的脂質(zhì)過氧化和神經(jīng)元變性，進(jìn)而加重AD的疾病嚴(yán)重程度［14］。此外，GGT水平升高還可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)血管動脈粥樣硬化斑塊的形成，加重AD患者認(rèn)知障礙損傷程度［4，15］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GGT水平升高是影響AD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，證實(shí)了血清GGT可能是一種新的AD血清標(biāo)志物，其可通過促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌，加重AD患者認(rèn)知功能損傷。

CTHRC1是一種細(xì)胞外分泌糖蛋白，參與血管重塑、骨形成、炎癥性關(guān)節(jié)炎和癌癥進(jìn)展等多種生理和病理過程［16］。AD的發(fā)生與神經(jīng)元線粒體損傷及能量轉(zhuǎn)換缺陷關(guān)系密切，神經(jīng)元可以將受損的線粒體轉(zhuǎn)移到星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理和回收，受損的線粒體產(chǎn)生損傷相關(guān)標(biāo)志物并釋放到腦脊液中。CTHRC1作為一種線粒體損傷的標(biāo)志物，可能參與AD的發(fā)生、發(fā)展過程［6］。在5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型中研究證實(shí)，線粒體功能障礙可導(dǎo)致Aβ肽血管沉積，從而形成淀粉樣血管病變，導(dǎo)致線粒體損傷蛋白CTHRC1能夠通過血腦屏障釋放到外周血［6］。本研究顯示，AD患者血清CTHRC1表達(dá)較健康體檢者明顯升高，提示CTHRC1可能參與AD的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦組織CTHRC1的表達(dá)與Aβ的表達(dá)呈正相關(guān)，CTHRC1可通過促進(jìn)細(xì)胞外淀粉樣斑塊沉積，促進(jìn)AD進(jìn)展［17］。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清CTHRC1表達(dá)與炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP呈正相關(guān)，與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)，表明CTHRC1表達(dá)升高可能通過加重AD患者炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AD患者認(rèn)知功能損傷。有研究表明，CTHRC1表達(dá)上調(diào)能夠激活經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt信號通路，促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，β-連環(huán)蛋白能夠直接促進(jìn)TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，加重組織炎癥反應(yīng)［18-19］。此外，有研究顯示，CTHRC1能夠通過激活單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、CRP并促進(jìn)組織基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，導(dǎo)致組織炎癥性損傷［20］。目前，臨床上對AD的診斷主要根據(jù)臨床表現(xiàn)及神經(jīng)心理量表，但早期診斷的敏感性和特異性不高。本研究中，血清GGT和CTHRC1聯(lián)合檢測對AD發(fā)生具有較高的診斷價值，臨床醫(yī)師可根據(jù)血清GGT和CTHRC1水平對AD疾病進(jìn)行早期診斷及治療，以提高AD患者的生活質(zhì)量，改善臨床預(yù)后。

綜上所述，GGT、CTHRC1可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)，從而參與AD發(fā)生、發(fā)展，加重AD患者認(rèn)知功能損傷，血清GGT、CTHRC1表達(dá)升高是影響AD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，兩者聯(lián)合檢測對AD具有較高的診斷價值，但本研究樣本量有限，未對AD患者治療過程中血清動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。