外周血單核細胞DNMT1及血清IL-6在糖尿病腎臟病中的表達及意義

許莉敏，謝燕

糖尿病腎?。―KD）是由糖尿病引起的微血管并發(fā)癥，以持續(xù)白蛋白尿和腎小球濾過率降低為主要特征［1-2］。DKD是導致終末期腎功能衰竭的重要病因之一，約占所有病因的30%，在發(fā)達國家中，DKD已經成為尿毒癥發(fā)生的主要影響因素［3］。腎小球濾過率估計值（eGFR）及24 h尿白蛋白排泄率（24 h UAER）是臨床評估DKD患者腎功能及病程分期的常用指標，但2個指標對DKD疾病早期診斷價值有限。既往研究顯示，DNA甲基化與DKD有關，而DNA甲基轉移酶1（DNMT1）是DNA甲基化的主要催化酶，能夠將甲基轉移到基因組DNA胞嘧啶核苷酸，負責DNA復制后的甲基化修飾，與人類發(fā)育異常、腫瘤及糖尿病等有關［4］。白細胞介素（IL）-6是重要的促炎細胞因子，可通過結合細胞表面的IL-6受體α，促進組織炎癥反應的發(fā)生。研究表明，DNMT1能夠促進脂多糖誘導的促炎細胞因子如IL-6和IL-8的表達，從而激活組織炎癥反應，加速DKD的疾病進展［5］。本研究旨在探討不同疾病嚴重程度的DKD患者DNMT1和IL-6的水平差異及其在DKD診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月—2021年4月于蘇州大學附屬第一醫(yī)院就診的DKD患者150例（DKD組），DKD診斷標準符合《中國糖尿病腎臟疾病防治臨床指南》［6］。納入標準：心、腎、肺等重要臟器功能良好；溝通能力良好，可獨立完成研究；配合醫(yī)師治療。排除標準：1型糖尿病、肝源性糖尿病、應激性糖尿病、胰源性糖尿病及生長抑素瘤、醛固酮瘤等導致的糖尿??；合并血液性系統(tǒng)疾??；合并精神疾?。蝗焉锲?；長期酗酒；臨床資料不完整致分組復雜性增加的患者；本研究期間正在接受其他研究的患者。另選取同期健康體檢者50例為對照組，2組研究對象的年齡、體質量指數（BMI）、性別、文化程度和吸煙史（目前正在吸煙或持續(xù)吸煙史≥6個月且≥1支/d）差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。本研究嚴格按照《赫爾辛基宣言》中的醫(yī)學研究倫理原則（倫理批號：TJ?IRB20191222）。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 收集DKD患者入院后及對照組健康查體時的總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血肌酐、空腹血糖等實驗室檢查指標。應用改良的MDRD公式計算eGFR=186×（血肌酐/88.4）-1.154×年齡-0.203×0.742（女性）。放射免疫法檢測24 h UAER。微柱層析法測定糖化血紅蛋白。

Tab.1 Comparison of baseline data between the two groups表1 2組基線資料比較

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IL-6水平 清晨空腹狀態(tài)下抽取靜脈血4 mL并置于無菌真空促凝管中，常溫放置20 min，3 000 r/min離心15 min，離心半徑11 cm，上清液置于-80℃冰箱保存。ELISA法檢測血清IL-6水平，試劑盒購自武漢基因美科技有限公司。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測DNMT1表達 清晨空腹狀態(tài)下抽取靜脈血4 mL后加入3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，通過Ficoll淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，置于-80℃保存待用。采用Trizol試劑提取的外周血單個核細胞中總RNA，將總RNA反轉錄為cDNA。PCR總反應體系（20μL）：cDNA 2μL，上、下游引物各1μL和SYBR Premix 10μL，雙蒸水6μL。引物合成由上海賽百盛公司完成。DNMT1引物：上 游 5′-TCAGTCGCAAGATGAAGCGT-3′，下 游 5′-CCCCAGTCAAACTACCCACC-3′；內參β-actin：上游5′-GT?GGGGCGCCCAGGCACCT-3′，下游5′-CTTCCTTAATGTCAC?GCACGATTG-3′。采用2-ΔΔCt法計算DNMT1的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。正態(tài)分布計量資料用表示，2組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Pearson相關分析。多因素Logistic回歸分析影響DKD發(fā)生的危險因素并建立24 h UAER、IL-6、DNMT1聯(lián)合診斷評估模型。受試者工作特征（ROC）曲線分析24 h UAER、IL-6、DNMT1及三者聯(lián)合檢測在DKD中的診斷價值，利用R軟件包3.6.3版本比較各指標曲線下面積（AUC），比較采用DeLong′s test檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組實驗室指標比較 與對照組比較，DKD組空腹血糖、IL-6、DNMT1、血肌酐、24 h UAER、LDLC、糖化血紅蛋白水平升高，而eGFR、HDL-C水平降低（均P＜0.05），2組的總膽固醇、三酰甘油差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD組和對照組實驗室指標比較

Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD組和對照組實驗室指標比較

＊＊P＜0.01；eGFR單位為mL/（min·1.73 m2）。

組別對照組DKD組t n 50 150空腹血糖（mmol/L）4.91±0.52 10.80±2.30 17.928＊＊IL-6（μg/L）52.23±3.17 70.05±4.01 28.571＊＊DNMT1 0.07±0.02 0.13±0.03 13.188＊＊血肌酐（μmol/L）62.14±10.55 91.74±22.98 8.793＊＊eGFR 104.89±14.62 80.17±10.82 12.749＊＊24 h UAER（mg）5.12±1.62 604.29±107.63 39.297＊＊總膽固醇（mmol/L）4.68±0.82 4.42±0.93 1.761三酰甘油（mmol/L）1.83±0.62 2.01±0.83 1.407 HDL-C（mmol/L）1.42±0.24 1.19±0.23 6.057＊＊LDL-C（mmol/L）2.41±0.75 3.61±0.86 8.180＊＊糖化血紅蛋白（%）0.67±0.08 9.08±1.12 52.963＊＊

2.2 DKD患者IL-6、DNMT1與其他臨床指標的相關性 DKD組患者IL-6與DNMT1呈正相關（r=0.560，P＜0.05）。IL-6、DNMT1與24 h UAER呈正相關（均P＜0.05），與空腹血糖、糖化血紅蛋白、血肌酐、eGFR、HDL-C、LDL-C均無相關性（均P＞0.05），見表3。

Tab.3 Correlation of IL-6,DNMT1 and clinical indicators in DKD patients表3 DKD患者IL-6、DNMT1與臨床指標的相關性

2.3 DKD影響因素分析 以是否發(fā)生DKD為因變量（是=1，否=0），以eGFR、24 h UAER、IL-6及DNMT1為自變量，Logistic回歸分析結果顯示，較高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影響DKD發(fā)生的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Analysis of influencing factors of DKD表4 DKD影響因素分析

2.4 24 h UAER、IL-6、DNMT1對DKD的診斷價值 24 h UAER、IL-6、DNMT1聯(lián)合檢測診斷DKD的 方 程 為：Log［P/（1-P）］=-1.867+0.258×（24 h UAER）+0.298×（IL-6）+0.776×（DNMT1）。聯(lián)合檢測診斷DKD的AUC高于24 h UAER、IL-6、DNMT1單一指標檢測（Z分別為4.429、4.327、1.879，均P＜0.01），見表5、圖1。

Tab.5 Diagnostic value of 24 h UAER,IL-6 and DNMT1 in diagnosing DKD表5 24 h UAER、IL-6、DNMT1對診斷DKD的診斷價值

Fig.1 ROC curve analysis of 24 h UAER,IL-6,DNMT1 and combined detection in the diagnosis of DKD圖1 24 h UAER、IL-6、DNMT1及聯(lián)合檢測診斷DKD的ROC曲線分析

3 討論

DKD是終末期腎病最常見的原因，易合并心力衰竭、腦卒中等心腦血管疾病，甚至導致患者死亡，嚴重威脅患者生命健康［7-8］。DKD的病因及發(fā)病機制較為復雜，多認為與高血糖引起的氧化應激損傷及炎癥反應有關，活性氧及晚期糖基化產物能夠激活系膜細胞中炎癥反應，導致腎小球系膜增生和腎小球間質的纖維化，最終導致DKD的發(fā)生［9］。目前，臨床上DKD的診斷主要依賴24 h UAER，但24 h UAER的測定受到感染、發(fā)熱及心力衰竭等多種因素的影響，在DKD診斷和預測DKD疾病進展上仍存在一定的局限性。因此，尋找能夠有效診斷DKD的血清標志物，對于延緩終末期腎病的發(fā)生具有重要的臨床意義。

IL-6為白細胞介素家族中的促炎細胞因子，大多由單核細胞、巨噬細胞分泌，成纖維細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞也可分泌少量IL-6。本研究中，DKD患者血清IL-6水平明顯升高，提示IL-6可能參與DKD的發(fā)病過程。有研究顯示，腎足細胞表達IL-6受體gp130，當腎足細胞受脂多糖、高血糖損傷刺激時，能夠促進IL-6的分泌［10］。24 h UAER是臨床常用的診斷DKD的指標，24 h UAER升高通常能夠增加DKD患者心血管事件和死亡風險。本研究中DKD患者IL-6的表達與24 h UAER呈正相關，證實了IL-6的表達升高可能參與DKD的發(fā)展。有研究發(fā)現，IL-6能夠通過促進腎足細胞中Jacus相關激酶2結合gp130并發(fā)生自身磷酸化，進而誘導信號轉導與轉錄活化因子3的磷酸化激活，促進足細胞肥大及凋亡，促進DKD的進展［11］。本研究中，多因素Logistic回歸分析結果證實，IL-6升高是影響DKD發(fā)生的獨立危險因素，提示IL-6升高是參與DKD疾病發(fā)生、發(fā)展的重要血清標志物。推測其機制，IL-6作為一種促炎細胞因子，可以招募并激活中性粒細胞、單核細胞以及巨噬細胞，促進腫瘤壞死因子α等促炎細胞因子的大量釋放，導致單核細胞以及巨噬細胞對腎小球基底膜組織的浸潤，進而使機體的炎癥損傷加重，氧化應激代謝發(fā)生異常，加重了腎小球基底膜損傷［12］。

表觀遺傳學是核苷酸序列的甲基化、乙?；刃揎椧鸹虮磉_的變化，從而參與機體炎癥、代謝等生理及病理學過程的調控，與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展關系密切［13］。岳銳等［14］研究認為，DNA甲基化可以通過影響細胞凋亡與代謝過程，從而對腎病患者的腎功能以及腎臟纖維化產生不利影響。DNMT1是負責維持DNA復制后甲基化模式的主要酶，可將甲基轉移到基因組DNA的胞嘧啶核苷酸上，該基因的表達失常與小腦共濟失調、腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關［4］。本研究結果顯示，DKD患者外周血單個核細胞中DNMT1表達明顯升高，并且其表達水平與24 h UAER呈正相關，提示DNMT1表達升高參與DKD的疾病發(fā)生、發(fā)展過程。Zhang等［15］研究顯示，DKD小鼠模型腎小球足細胞的DNMT1蛋白呈高表達，表明DNMT1促進了糖尿病腎病足細胞的炎癥性損傷，而在使用DNA甲基化抑制劑5-Aza后蛋白尿的水平明顯降低，足細胞損傷程度也有所減輕。本研究進一步證實，DNMT1升高是影響DKD發(fā)生的獨立危險因素。Chen等［16］研究發(fā)現，糖尿病患者外周血單核細胞中DNMT1的上調能夠誘導哺乳動物雷帕霉素靶蛋白啟動子區(qū)域胞嘧啶異常甲基化，引起哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路的過度激活，進而加重糖尿病腎臟組織的過度炎癥。本研究中DNMT1與IL-6表達呈顯著正相關，提示DNMT1與IL-6的表達可能存在相互作用的關系。分析其機制，一方面，IL-6能夠直接激活DNMT1的表達，進而抑制下游E-鈣黏蛋白的表達，促進細胞間質化，加重腎臟纖維化［17］；另一方面，DNMT1的表達升高能夠抑制IL-6的甲基化水平，促進IL-6的表達，參與DKD疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［18］。本研究通過ROC分析發(fā)現，24 h UAER、DNMT1與IL-6聯(lián)合檢測診斷DKD的AUC顯著高于各單一指標檢測，提示三者聯(lián)合檢測是診斷DKD的良好指標，可作為后續(xù)臨床診斷的可行參考。

綜上所述，IL-6、DNMT1在DKD患者中表達上調，與DKD患者的病情發(fā)展情況密切相關。較高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影響DKD發(fā)生的獨立危險因素，24 h UAER、DNMT1、IL-6聯(lián)合檢測可作為DKD臨床診斷的預測指標。然而，本研究納入的樣本量相對較少，未對可能參與DKD患者病情發(fā)展的其他炎癥因子如腫瘤壞死因子α、IL-1β等進行研究，有待今后進一步擴大樣本量，并對其他可能參與DKD疾病發(fā)生、發(fā)展的其他炎癥因子進行探索。