鹽脅迫下花生種子萌發(fā)期代謝組學(xué)分析

徐揚(yáng) 丁紅 張冠初 郭慶 張智猛 戴良香

（山東省花生研究所，青島 266100）

我國(guó)鹽堿地分布廣泛，面積約為3.6×107hm2［1］，是重要的現(xiàn)實(shí)和潛在的農(nóng)業(yè)資源，但目前保護(hù)性開(kāi)發(fā)利用率較低。2021年習(xí)近平總書記在黃河三角洲視察工作時(shí)做出了“端穩(wěn)中國(guó)糧、鹽堿地大有可為”的重要批示，為開(kāi)發(fā)利用鹽堿地、保障我國(guó)糧食安全指明了新方向?；ㄉ痰B(yǎng)地，耐瘠抗旱，并具備較強(qiáng)鹽堿耐受能力，是目前鹽堿地區(qū)較適宜種植的經(jīng)濟(jì)和油料作物之一［2-3］。但鹽堿地較高的土壤鹽分會(huì)在種子周圍形成高滲透勢(shì)、離子（Na+和Cl-）和氧化毒害［4-5］，導(dǎo)致花生種子發(fā)芽率降低、出苗時(shí)間延長(zhǎng)、健苗率低、嚴(yán)重減產(chǎn)［6-7］，成為限制鹽堿地花生生產(chǎn)的瓶頸。因此，如何“促萌發(fā)、保全苗、成壯苗”是提高鹽堿地花生產(chǎn)量和擴(kuò)大種植面積的關(guān)鍵，對(duì)鹽堿地農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和花生產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

種子萌發(fā)過(guò)程中代謝活動(dòng)較旺盛［8］，吸水膨脹會(huì)激活新陳代謝、產(chǎn)生能量、降解高分子內(nèi)含物并產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，涉及氨基酸、糖酵解、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸等多條代謝途徑［9］。種子萌發(fā)的代謝過(guò)程對(duì)種子發(fā)芽及植株形態(tài)建成至關(guān)重要，已逐漸成為評(píng)價(jià)種子活力和品質(zhì)的重要指標(biāo)［10-11］。目前關(guān)于花生種子萌發(fā)過(guò)程中物質(zhì)變化的研究主要集中在內(nèi)源激素等生理生化指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)成分變化及基因調(diào)控等方面［12-14］，對(duì)鹽脅迫下花生種子萌發(fā)期代謝物動(dòng)態(tài)變化的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用且兼具耐鹽能力的花育22 號(hào)為試驗(yàn)材料，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，監(jiān)測(cè)鹽脅迫下花生種子不同萌發(fā)階段相關(guān)代謝產(chǎn)物變化，探索花生鹽脅迫應(yīng)答引發(fā)的萌發(fā)過(guò)程代謝物變化規(guī)律，為通過(guò)遺傳育種和外源調(diào)控促進(jìn)鹽堿地花生萌發(fā)出苗提供重要代謝物資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試花生品種為花育22 號(hào)，由山東省花生研究所提供。選取當(dāng)年收獲的籽粒飽滿、均勻一致的種子2 kg 備用。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)階段代謝組學(xué)樣品的培養(yǎng)與采集 先將備好的花生種子用0.5%次氯酸鈉消毒，無(wú)菌水沖洗5、6 次，吸水紙吸干水分后備用。設(shè)置2 個(gè)NaCl 處理濃度（0 和150 mmol/L），3 個(gè)吸水膨脹時(shí)間（0 h、6 h 和72 h）。將花生種子（20 粒）置于直徑為120 mm、底部墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿中分別加入處理要求的同體積（70 mL）培養(yǎng)液，使種子分別均勻半浸于0 或150 mmol/L 的培養(yǎng)液中，置于28℃暗培養(yǎng)箱中吸脹萌發(fā)，每處理6 次重復(fù)。分別于培養(yǎng)后0 h、6 h 和72 h 以重復(fù)為單位隨機(jī)采集各處理皿6 粒種子樣品，置于無(wú)菌袋中，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)浞治鲇谩２煌幚砗蛯?duì)照組命名如下：正常條件（0 mmol/L NaCl 即ddH2O，CK）吸水膨脹0 h、6 h 和72 h 各時(shí)段的種子樣本分別表示為CK0、CK6 和CK72，150 mmol/L NaCl（S）吸水膨脹0 h、6 h 和72 h 各時(shí)段的種子樣本分別表示為S0、S6、S72，每處理6 次重復(fù)。其中CK0與S0 皆為吸水膨脹0 h，因處理一致統(tǒng)一為對(duì)照（CK）進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)。經(jīng)前期研究表明6 h 為花生種子快速吸水膨脹期，72 h 為花生種子胚根伸長(zhǎng)期［15-16］。樣品由青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測(cè)有限公司同批次檢測(cè)完成。

1.2.2 花生發(fā)芽率統(tǒng)計(jì) 將20 粒/皿花生種子半浸于150 mmol/L NaCl 基質(zhì)或ddH2O 培養(yǎng)皿（70 mL），均置于28℃暗培養(yǎng)箱中吸脹萌發(fā)，每隔2 d 補(bǔ)充NaCl 溶液和ddH2O，6 次生物學(xué)重復(fù)。自浸種之日起至8 d 每天定時(shí)進(jìn)行種子發(fā)芽率調(diào)查（胚根突破種皮3 mm 即視為發(fā)芽）。發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽種子數(shù)/供試花生種子總數(shù)）×100%［17］。

1.2.3 代謝組學(xué)檢測(cè)

1.2.3.1 代謝組學(xué)樣品提取 1 000 mg 樣品加入1.3 mL 提取液（甲醇∶水=4∶1；V∶V），低溫下高通量組織破碎儀破碎，低溫渦旋混勻處理30 min。4℃13 000×g離心15 min，取上清后重復(fù)上述萃取操作3 次，將上清液在氮?dú)庀禄旌蠞饪s。最終，樣品用乙腈∶水=1∶100 μL（V∶V）復(fù)溶后用于液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.2.3.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析 色譜條件：儀器為超高效液相色譜儀（Thermo Vanquish UHPLC，Thermo Fisher Scientific）和Zorbax Eclipse C18色譜柱（1.8 μm×2.1×100 mm，Agilent technologies）；柱溫為30℃；流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相組成A（水+0.1%甲酸）和B（純乙腈）；進(jìn)樣量為2 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4℃。質(zhì)譜條件：儀器為高分辨質(zhì)譜（Q-Exactive HF，Thermo Fisher Scientific），分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。離子化模式為加熱電噴霧離子源（heated electron spray ionization，HESI）；質(zhì)譜掃描范圍在100-1 500 m/z，掃描速度為1 000 Da/s。環(huán)設(shè)定為最大值3；隔離窗口設(shè)置為2；動(dòng)態(tài)扣除為10 s；噴霧電壓3.50 kV；毛細(xì)管溫度330℃；加熱器溫度325℃。鞘氣、輔助氣體和吹掃氣體分別50.0、12.0 和1.0 arbitrary units。校準(zhǔn)溶液用于儀器校準(zhǔn)，在全掃描模式（FM）下進(jìn)行分析。一級(jí)MS掃描的分辨率設(shè)置為120 000，二級(jí)MS/MS 掃描的分辨率為60 000。填充C-Trap 的離子數(shù)為1e6，最大注射時(shí)間30 ms。標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）12.5、25 和35 eV；隔離窗口（isolation window，IW）為3；Loop 設(shè)置為2。

1.2.3.3 代謝物定性和數(shù)據(jù)分析 使用Compound Discoverer 3.1 進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等工作，同時(shí)利用Thermo mzCloud 在線數(shù)據(jù)庫(kù)，Thermo mzValut 本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，ChemSpider 數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行物質(zhì)鑒定。數(shù)據(jù)預(yù)處理后，利用Simca-Pv13.0（UmetricsAB，Umea，Sweden）進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），利用PLINK軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），兩者用于研究組間代謝物差異變化情況；利用R 語(yǔ)言軟件包進(jìn)行PCA 和PLS-DA 的分析繪制［18］；采用PLS-DA 模型得到的變量權(quán)重值（variable importance in projection，VIP>1），并結(jié)合student'st-test（P<0.05）和差異倍數(shù)（fold change ≥2 和fold change ≤0.5）相結(jié)合的方法篩選差異代謝物［19］。KEGG 是研究生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的重要工具，本研究利用超幾何檢驗(yàn)篩選與比較分析差異代謝物富集的KEGG pathway，獲得差異代謝物參與的重要代謝通路［19］。在美吉I-Sanger 云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)上（www.majorbio.com）對(duì)所有測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用SPSS 20 軟件，采用Student'st-test 比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2.4 種子營(yíng)養(yǎng)成分含量分析 花生種子可溶性蛋白含量測(cè)定采用雙縮脲法（Biuret）；脂肪含量測(cè)定采用索氏抽提法（GB/T5009.6-2016）；可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法［20］。

2 結(jié)果

2.1 鹽脅迫下花生種子發(fā)芽率及種子營(yíng)養(yǎng)成分含量分析

如圖1-A 顯示，鹽脅迫下花生種子發(fā)芽速率較慢，發(fā)芽率降低，至培養(yǎng)8 d 其發(fā)芽率只有83.5%，顯著低于正常條件（100%）。淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪作為種子中的重要組成部分，其在種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)生劇烈變化，可溶性蛋白質(zhì)隨種子萌發(fā)時(shí)間的推進(jìn)，含量逐漸降低，但到萌發(fā)后期即胚根伸長(zhǎng)期（72 h）含量增加（圖1-B），而脂肪和可溶性糖含量則隨萌發(fā)過(guò)程的推進(jìn)不斷降低，在種子胚根伸長(zhǎng)期其含量下降到較低水平（圖1-C，1-D）。鹽脅迫處理下花生種子可溶性蛋白、脂肪和可溶性糖的含量變化趨勢(shì)與正常條件相同，但含量均低于對(duì)照。鹽脅迫下吸水膨脹期（6 h）和胚根伸長(zhǎng)期（72 h）可溶性蛋白含量分別較正常條件降低8.89%和6.25%，可溶性糖含量分別降低15.79%和20.00%（圖1-B，1-D）。綜上結(jié)果表明，花生種子萌發(fā)需消耗大量蛋白質(zhì)、糖類和脂肪類物質(zhì)用于供能，鹽脅迫較正常萌發(fā)需消耗更多的能量，可能與脅迫應(yīng)答有關(guān)。

圖1 鹽脅迫和正常條件下花生種子發(fā)芽率和種子營(yíng)養(yǎng)成分含量分析Fig.1 Analysis of peanut seed germination rate and seed nutrient component under salt stress and normal condition

2.2 主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

PCA 分析本質(zhì)上是一種無(wú)監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。對(duì)花生種子不同萌發(fā)條件、不同萌發(fā)時(shí)段的代謝物檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行PCA 分析顯示，正常萌發(fā)條件下吸水膨脹6 h（吸水膨脹期，CK6）與對(duì)照（吸水膨脹0 h，CK）聚為一類，正常條件下吸水膨脹72 h（胚根伸長(zhǎng)期，CK72）與其分離，但仍處于同一象限；而鹽脅迫處理組（S6 與S72）與正常條件各組均存在明顯差異，分布于不同象限，表明鹽脅迫顯著改變萌發(fā)期代謝（圖2-A）。PLS-DA 分析可用于評(píng)價(jià)多變量樣本間差異分析，如圖2-B 所示，CK6 與CK 聚為一類，而CK72 與其分離，表明萌發(fā)后期物質(zhì)能量代謝較前期變化更大。鹽脅迫處理組（S6 與S72）與正常條件各組均存在明顯差異，分布于不同象限，表明鹽脅迫處理較種子萌發(fā)本身改變花生種子代謝的效果更顯著，與PCA 結(jié)果一致。PCA 和PLS-DA 分析圖上QC 樣本密集分布，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較高（圖2-A，B）。而組內(nèi)樣本表現(xiàn)更聚集，差異性較小，且樣本全部處于95%置信區(qū)間，說(shuō)明重復(fù)間差異小，取樣較合理（圖2-A，B）。PLS-DA 正負(fù)離子模式的模型參數(shù)分別為R2Y=0.4981，Q2=0.7536（圖2-C）。Q2表示模型的可預(yù)測(cè)性，Q2大于0.5，表明處理樣本間存在明顯差異（圖2-C）。同時(shí)，Q 的回歸線與縱軸的截距在零以下，體現(xiàn)了原模型具有良好的穩(wěn)定性。PLS-DA 分析表明，該方法能較好的將鹽脅迫和正常萌發(fā)下不同萌發(fā)階段的花生種子區(qū)分開(kāi)來(lái)，不存在過(guò)度擬合現(xiàn)象，穩(wěn)健性良好，結(jié)果可用于后續(xù)的代謝物差異成分分析。

圖2 PCA 和PLS-DA 分析Fig.2 PCA and PLS-DA analysis

2.3 差異代謝物篩選

為進(jìn)一步分析鹽脅迫對(duì)花生種子萌發(fā)期代謝物的影響，需要對(duì)VIP 值進(jìn)行計(jì)算。結(jié)合PLSDA 模型和方差分析（one-way ANOVA）篩選（fold change ≥2 和fold change ≤0.5，同時(shí)VIP>1.0 及student'st-test 的P<0.05）差異代謝物，正常萌發(fā)不同時(shí)段，CK6 與CK 相比，正負(fù)離子模式下分別鑒定出差異代謝物5 和6 個(gè)，上調(diào)表達(dá)1 和3 個(gè)，下調(diào)表達(dá)4 和3 個(gè)（圖3-A）；CK72 與CK 相比，正負(fù)離子模式下分別鑒定差異代謝物23 和16 個(gè)，上調(diào)表達(dá)14 和3 個(gè)，下調(diào)表達(dá)9 和13 個(gè)（圖3-B）；CK72 與CK6 相比，正負(fù)離子模式下分別鑒定差異代謝物5 和9 個(gè)，上調(diào)表達(dá)1 和6 個(gè)，下調(diào)表達(dá)4和3 個(gè)（圖3-C）。

鹽脅迫與正常條件同時(shí)段比較，S6 與CK6 正負(fù)離子模式下分別鑒定出差異代謝物69 和56 個(gè)，上調(diào)表達(dá)48 和42 個(gè)，下調(diào)表達(dá)21 和14 個(gè)（圖3-D）；S72 與CK72 正負(fù)離子模式下分別鑒定出差異代謝物69 和67 個(gè)，上調(diào)表達(dá)45 和34 個(gè)，下調(diào)表達(dá)24和33 個(gè)（圖3-E）。鹽脅迫不同時(shí)段比較分析顯示，S72 與S6 比較正負(fù)離子模式下分別鑒定出差異代謝物16 和18 個(gè)，上調(diào)表達(dá)4 和2 個(gè)，下調(diào)表達(dá)12 和16 個(gè)（圖3-F）。鹽脅迫與對(duì)照比較：S6 與CK 正負(fù)離子模式下分別鑒定出差異代謝物65 和45 個(gè)，上調(diào)表達(dá)20 和12，下調(diào)表達(dá)45 和33（圖3-G）；S72與CK 正負(fù)離子模式分別鑒定出差異代謝物68 和49個(gè)，上調(diào)表達(dá)25 和22 個(gè)，下調(diào)表達(dá)43 和27 個(gè)（圖3-H）。表明花生種子萌發(fā)后期（胚根伸長(zhǎng)期）較前期（吸水膨脹期）差異代謝物更多，這與隨花生種子萌發(fā)期代謝活動(dòng)趨于旺盛有關(guān)。另外，鹽處理顯著改變了花生種子萌發(fā)期代謝，差異代謝物數(shù)量較正常條件增加。試驗(yàn)篩選出的差異代謝物為進(jìn)一步深入分析提供了有效的數(shù)據(jù)支持。

圖3 正負(fù)離子模式下不同處理比較差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano plot of date in the positive and negative ion modes of differential metabolites under different treatments

2.4 正常條件下花生種子不同萌發(fā)時(shí)段差異代謝物KEGG pathway分析

將全部差異代謝物提交至KEGG 網(wǎng)站，進(jìn)行KEGG pathway 分析。結(jié)果顯示，CK6vsCK 差異代謝物（皆為目前尚未定義或分類的代謝物）未定位到KEGG pathway，CK72vsCK 差異代謝物共富集到12個(gè)KEGG pathway（表1）。其中6 種氨基酸包括左旋絡(luò)氨酸（L-Tyrosine）共參與6 個(gè)代謝通路，亮氨酸（Leucine）和左旋精氨酸（L-（+）-Arginine）各參與3 個(gè)代謝通路；左旋組氨酸（L-Histidine）、左旋甲硫氨酸（L-Methionine）、左旋脯氨酸（L-Methionine）各參與2 個(gè)代謝通路。苯乙酰胺（2-Phenylacetamide）和羥基肉桂酸（2-Hydroxycinnamic acid）主要參與苯丙氨酸代謝。正常條件下不同萌發(fā)時(shí)段差異代謝物比較分析顯示，CK72vsCK6 差異代謝物含量均升高，共富集到10 個(gè)KEGG pathway，表明胚根伸長(zhǎng)期較吸水膨脹期有更多的代謝物和代謝通路變化（表2）。KEGG pathway 分析顯示各差異代謝物除主要涉及氨基酸合成與代謝相關(guān)的信號(hào)通路，還涉及乙醛酸和二羧酸代謝、氮代謝以及光合作用（泛醌及其他萜類醌生物合成、卟啉和葉綠素代謝），并且隨種子萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，差異代謝物增加，所涉及的代謝通路也更多。

表1 正常條件下花生種子萌發(fā)胚根伸長(zhǎng)期與對(duì)照組（CK72vsCK）差異代謝物富集KEGG pathwayTable 1 Differential metabolites enriched KEGG pathway at radicle extension period compared with CK group（CK72vsCK）in peanut seed germinated under normal condition

表2 正常條件下花生種子萌發(fā)胚根伸長(zhǎng)期與吸水膨脹期（CK72vsCK6）差異代謝物富集KEGG pathwayTable 2 Differential metabolites enriched KEGG pathway in comparison of radicle extension period with water absorption period（CK72vsCK6）in peanut seed germinated under normal condition

2.5 鹽脅迫下花生種子萌發(fā)期差異代謝物KEGG pathway分析

同一萌發(fā)時(shí)段不同處理下花生種子差異代謝物分析顯示，S6 與CK6 相比，鹽處理后能定位到KEGG pathway 的差異代謝物表達(dá)水平均提高，尤其是甜菜堿和脯氨酸兩種滲透保護(hù)物。差異代謝物共參與26 個(gè)KEGG pathway，主要包括氨基酸合成及代謝、糖代謝、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)（TCA）等代謝過(guò)程，還涉及甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝、芥子油苷生物合成（表3）。S72 與CK72 相比，鹽處理后能定位到KEGG pathway 的差異代謝物除硫胺素含量降低，其他差異代謝物含量均顯著提高，共參與31 個(gè)差異代謝物富集KEGG pathway，其中包括與S6vsCK6 相同的26 個(gè)通路，并增加了5 個(gè)代謝通路，包括3 個(gè)氨基酸代謝（半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、組氨酸代謝、絡(luò)氨酸代謝）、硫胺素代謝和異喹啉生物堿生物合成途徑（表4）。不同萌發(fā)時(shí)段差異代謝物比較分析顯示，S72 與S6 相比，PC（16:0/0:0）、脫氧腺苷和硫氨酸含量降低，而6 種代謝物包括左旋絡(luò)氨酸、甲硫氨酸、左旋組氨酸、羥基肉桂酸、乙酰氨基和苯基酰胺含量均顯著升高，主要涉及多種氨基酸代謝、能量代謝和芥子油苷合成等多條途徑（表5）。鹽脅迫下花生種子胚根伸長(zhǎng)期比種子吸水膨脹期有更多的差異代謝物和KEGG pathway 變化，與正常萌發(fā)結(jié)果一致。另外，鹽脅迫處理比同時(shí)段正常萌發(fā)KEGG pathway 變化更復(fù)雜，除涉及糖代謝（半乳糖代謝，磷酸戊糖途徑）、脂肪代謝（甘油磷脂代謝、檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝等）、氨基酸代謝、光合作用相關(guān)途徑外，甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝和芥子油苷生物合成途徑也發(fā)生了變化，這些代謝途徑與脅迫應(yīng)答密切相關(guān)，可能對(duì)鹽脅迫下花生種子萌發(fā)有利。

表3 花生種子萌發(fā)吸水膨脹期鹽脅迫與正常條件（S6vsCK6）對(duì)比差異代謝物富集KEGG pathwayTable 3 Differential metabolites enriched KEGG pathway at water absorption period in peanut seed germinated under salt stress and normal condition（S6vsCK6）

表4 花生種子萌發(fā)胚根伸長(zhǎng)期鹽脅迫與正常條件（S72vsCK72）對(duì)比差異代謝物富集KEGG PathwayTable 4 Differential metabolites enriched KEGG pathway at radicle extension period in peanut seed germinated under salt stress and normal condition（S72vsCK72）

表5 鹽脅迫下花生種子萌發(fā)胚根伸長(zhǎng)期與吸水膨脹期（S72vsS6）對(duì)比差異代謝物富集KEGG pathwayTable 5 Differential metabolites enriched KEGG pathway in comparison of radicle extension period with water absorption period（S72vS6）in peanut seed germinated under salt stress

S6vsCK 比較組差異代謝物及KEGG pathway 與S6vsCK6 組相類似，除亮氨酸和腺苷僅在S6vsCK6組中被檢測(cè)到，而槲皮苷和蕓香苷2 種差異代謝物僅在S6vsCK 組中，其主要涉及黃酮和黃酮醇的生物合成及類黃酮生物合成途徑（表6）。而S72vsCK與S72vsCK72 兩組差異代謝物及KEGG pathway 比較顯示，S72vsCK 比較組中未檢測(cè)到腺苷，而鑒定到槲皮苷和蕓香苷（表7）。S6 及S72 與CK 比較存在兩個(gè)變量，即萌發(fā)條件和萌發(fā)時(shí)間的差異，故與單一變量比較組（S6vsCK6 及S72vsCK6）結(jié)果不同，也進(jìn)一步佐證除鹽脅迫處理外，萌發(fā)本身也會(huì)改變代謝。

表6 花生種子萌發(fā)鹽脅迫吸水膨脹期與對(duì)照比較（S6vsCK）差異代謝物富集KEGG pathwayTable 6 Differential metabolites enriched KEGG pathway at water absorption period in peanut seed germinated under salt stress compared with control group（S6vsCK）

表7 花生種子萌發(fā)鹽脅迫胚根伸長(zhǎng)期與對(duì)照比較（S72vsCK）差異代謝物富集KEGG pathwayTable 7 Differential metabolites enriched KEGG pathway at radicle extension period in peanut seed germinated under salt stress compared with control group（S72vsCK）

3 討論

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜變化的過(guò)程，起始于吸水膨脹，結(jié)束于胚根出芽，是植物生命周期的初始階段，決定了整個(gè)生命過(guò)程的成?。?1-22］。能量代謝是種子萌發(fā)的基礎(chǔ)，可溶性糖參與的糖酵解以及脂肪參與的乙醛酸循環(huán)、丙酮酸代謝等代謝途徑是種子萌發(fā)的能量來(lái)源［11,23］。本研究發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)過(guò)程可溶性糖類和脂肪類含量逐漸降低，可能與其不斷分解持續(xù)供能有關(guān)。蛋白類物質(zhì)在種子吸水激活后不斷分解為種子的呼吸氧化過(guò)程提供碳源及氮源［24］，其含量不斷降低，其不斷生產(chǎn)的氨基酸又會(huì)繼續(xù)組裝成新細(xì)胞的蛋白質(zhì)，故蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，本研究與之前研究結(jié)果一致［20］。

差異代謝物鑒定及KEGG pathway 富集檢測(cè)顯示，鹽脅迫顯著促進(jìn)了甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝、芥子油苷生物合成途徑以及能量代謝等相關(guān)通路。甘油磷脂是細(xì)胞膜等生物膜的重要組成物質(zhì)，也是重要的信號(hào)分子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境反應(yīng)中起重要作用［25-26］。棉花種子可通過(guò)提升甘油磷脂代謝水平增強(qiáng)耐鹽性［27］；紫花苜蓿通過(guò)提高甘油磷脂類物質(zhì)的含量提高抗旱性［28］。本研究發(fā)現(xiàn)甘油磷脂代謝相關(guān)的差異代謝物在鹽脅迫處理后均上調(diào)表達(dá)，猜測(cè)鹽脅迫條件下花生種子可通過(guò)提升甘油磷脂代謝水平，維護(hù)細(xì)胞膜的正常功能，促進(jìn)體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，增強(qiáng)萌發(fā)期耐鹽性。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，植物通過(guò)形成谷胱甘肽等抗氧化劑抵御逆境脅迫［29］。水稻種子可通過(guò)增強(qiáng)谷胱甘肽代謝提高細(xì)胞抵御氧化脅迫能力，調(diào)控萌發(fā)過(guò)程［30］；冬小麥也能提高谷胱甘肽等代謝增強(qiáng)鎘耐受［31］。本研究中，鹽脅迫處理后提高的谷胱甘肽代謝可能對(duì)鹽脅迫下花生種子萌發(fā)有一定幫助。芥子油苷是一類有生物學(xué)活性的植物次生代謝物，與滲透保護(hù)化合物的合成有關(guān)，可通過(guò)提高耐滲透脅迫能力增強(qiáng)鹽脅迫抗性［32-33］。有研究表明，外源茉莉酸處理能促進(jìn)鹽芥花青素和芥子油苷的積累，提高植物抗氧化活性［34］；外源色氨酸處理可通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素IAA合成途徑和吲哚族芥子油苷的合成途徑相關(guān)基因表達(dá)，有效地促進(jìn)油菜生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和生物防御物質(zhì)的累積，提高抗病性［35］。本研究發(fā)現(xiàn)芥子油苷生物合成途徑相關(guān)差異代謝物在鹽處理后被顯著誘導(dǎo)，可能對(duì)鹽脅迫下花生種子萌發(fā)有一定促進(jìn)作用。能量代謝除參與正常生命活動(dòng)外，在植物響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中也發(fā)揮重要作用［36］。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理后，大量氨基酸代謝，糖代謝和脂肪代謝相關(guān)KEGG pathway 的差異代謝物顯著上調(diào)，可能與鹽脅迫下花生種子萌發(fā)需要更多的能量參與脅迫應(yīng)答有關(guān)。綜上可見(jiàn)，鹽脅迫條件下花生種子萌發(fā)期可通過(guò)提高甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝、芥子油苷生物合成和能量代謝等代謝途徑增強(qiáng)花生種子萌發(fā)期耐鹽性，適應(yīng)外界鹽脅迫。

甜菜堿和脯氨酸是植物重要的滲透保護(hù)物，可通過(guò)提高滲透調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)植物耐鹽性［37-38］。外源甜菜堿可提高苜蓿種子及幼苗的耐鹽能力，促進(jìn)苜蓿在鹽漬環(huán)境下的生長(zhǎng)發(fā)育［39］；甜菜堿浸種能促進(jìn)鹽脅迫下石榴種子萌發(fā)，有效提高幼苗耐鹽性［40］。脯氨酸浸種可提高鹽脅迫下的玉米發(fā)芽率，其過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增強(qiáng)［41］，還可降低鹽脅迫對(duì)油菜種子的抑制，促進(jìn)其萌發(fā)出苗［42］。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理能顯著提高甜菜堿和脯氨酸的含量，推測(cè)這兩種滲透保護(hù)物可能對(duì)花生種子萌發(fā)有利。本研究為遺傳育種和外源調(diào)控提供重要代謝物資源，未來(lái)可通過(guò)外源浸種或遺傳轉(zhuǎn)化方式，研究諸如甜菜堿和脯氨酸在花生種子萌發(fā)期的生物學(xué)功能，為促進(jìn)鹽堿地花生萌發(fā)出苗提供可靠途徑。

4 結(jié)論

對(duì)鹽脅迫下花生種子萌發(fā)不同時(shí)期代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胚根伸長(zhǎng)期較吸水膨脹期物質(zhì)能量代謝更旺盛，甜菜堿和脯氨酸可能是花生種子萌發(fā)期適應(yīng)

鹽脅迫的關(guān)鍵調(diào)控因子，甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝以及芥子油苷生物合成等途徑可能是重要的代謝調(diào)控通路，可為進(jìn)一步揭示花生種子萌發(fā)期的耐鹽調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。