解磷菌PSB-R全基因組測(cè)序鑒定及其解磷特性分析

王帥 呂鴻睿 張昊 吳占文 肖翠紅 孫冬梅，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶163319）

磷是植物生長(zhǎng)不可或缺的第二大量元素，在植物的生長(zhǎng)代謝過程中發(fā)揮著重要作用。缺磷將影響農(nóng)作物氮的有效積累并導(dǎo)致光合作用效率降低，降低作物的產(chǎn)量與質(zhì)量［1］。一方面，磷在環(huán)境中廣泛存在，我國(guó)耕地土壤中磷素含量豐富，但其中95%的磷元素是以礦物態(tài)存在，植物能夠直接吸收的可利用態(tài)略低［2］；另一方面，磷在環(huán)境中釋放后，往往很難回收，因此目前面臨“磷枯竭”問題。此外，過多的磷釋放反而又導(dǎo)致了環(huán)境磷對(duì)水體的污染，如富營(yíng)養(yǎng)化問題［3］。因此，提高土壤磷利用的研究仍有重要意義?，F(xiàn)有研究表明，向土壤中施加解磷微生物能夠有效改善土壤理化狀況，提高作物的產(chǎn)量［4-5］?，F(xiàn)有研究顯示，已分離到的解磷細(xì)菌主要集中在厚壁菌門、變形菌門和放線菌門的17 個(gè)屬中［6-7］，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）；解磷真菌［8］主要是曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和菌根菌（Arbuscularmy）。

目前解磷菌的研究應(yīng)用仍存在問題有待解決。首先，部分解磷菌穩(wěn)定性不佳，存在多次傳代后解磷能力退化的現(xiàn)象［1,9］；其次，解磷菌的解磷機(jī)制尚未完全探明，同一解磷菌在不同環(huán)境下發(fā)揮解磷作用的機(jī)制并不相同［1,7,9-10］。作為分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)，目前已解析的解磷菌基因組信息較少，仍需要研究者們不斷補(bǔ)充新的基因組信息作為解磷機(jī)制研究的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。為了克服上述瓶頸，近些年來(lái)學(xué)者們不斷嘗試從各種環(huán)境中分離出新的解磷菌株［11-14］，并對(duì)能力較強(qiáng)的解磷菌進(jìn)行全基因組測(cè)序［15］，嘗試解析解磷菌發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

本研究分離得到一株對(duì)多種難溶性磷酸鹽均具有解磷能力的解磷菌株P(guān)SB-R，通過響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件探究了其最大的解磷能力；在多次傳代培養(yǎng)后解磷能力能夠穩(wěn)定保持在較高水平，具備應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的潛力，為適用于東北地區(qū)的微生物菌肥開發(fā)和研制提供新的菌種資源。另外本研究還利用二代測(cè)序平臺(tái)Illumina NovaSeq PE150 進(jìn)行了全基因組測(cè)序并分析預(yù)測(cè)了PSB-R 包含的與解磷能力和植物促生相關(guān)基因，為進(jìn)一步從分子角度研究PSB-R解磷機(jī)制提供了基因組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，硫酸銨0.5，氯化鈉0.3，氯化鉀0.3，硫酸鎂0.3，硫酸亞鐵0.03，硫酸錳0.03，磷酸三鈣10.0，pH 自然。固體培養(yǎng)基按比例添加1.3%瓊脂粉。

NA 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10.0，牛肉粉 3.0，氯化鈉 5.0，pH 自然。固體培養(yǎng)基按比例添加1.3%瓊脂粉。

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PSB-R 的鑒定 將PSB-R 分別接種在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，觀察菌落形態(tài)特征；取一環(huán)細(xì)菌進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，觀察菌體形態(tài)；使用通用引物27F 和1492R 擴(kuò)增16S rRNA 基因序列，序列上傳至國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心登錄號(hào)為NMDCN0000R23。將PSB-R 的16S rRNA 基因序列上傳至EzbioCloud 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)合16S rDNA 分類結(jié)果設(shè)計(jì)生理生化試驗(yàn)。最后使用MiGA 對(duì)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行ANI 分析，確定PSB-R 分類地位。

1.2.2 全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)處理和分析 使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取PSB-R 基因組DNA，測(cè)定濃度及質(zhì)量符合測(cè)序要求后進(jìn)行DNA 文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina PE150。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉質(zhì)量值較低信息后使用SOAPde novo（version 2.04）進(jìn)行組裝，并對(duì)基因組堿基數(shù)量、（G+C）%、scaffold 數(shù)量等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組裝好的基因組信息上傳至國(guó)家基因組數(shù)據(jù)中心［16］。使用GeneMarkS（Version 4.17）軟件對(duì)PSB-R 基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)；采用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PSB-R 基因組信息進(jìn)行功能注釋。采用antiSMASH 程序?qū)SB-R 進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物預(yù)測(cè)。根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果，結(jié)合前人研究結(jié)果對(duì)基因組中植物促生相關(guān)基因進(jìn)行篩選。

1.2.3 培養(yǎng)基中可溶磷含量及鐵離子含量測(cè)定方法 培養(yǎng)基中可溶性磷含量的測(cè)定方法和相關(guān)試劑配置方法參考NY/T 2421-2013 植株全磷含量測(cè)定鉬銻抗比色法［17］進(jìn)行。具體方法為：取離心后的培養(yǎng)基1 mL 加入已裝有15 mL 蒸餾水的容量瓶（25 mL）中，加入100 μL 二硝基酚指示劑，滴加適量濃度為0.05 mol/L 的稀硫酸溶液，使容量瓶中溶液顏色變?yōu)榈S色，再向容量瓶中加入2.5 mL 鉬銻抗顯色液并用蒸餾水定容至刻線，顛倒混勻后置于25℃溫箱靜置30 min，測(cè)定反應(yīng)液在波長(zhǎng)700 nm 處的吸光度。

培養(yǎng)基中鐵離子含量的測(cè)定方法和相關(guān)試劑配置方法參考GBT2441.4-2010 尿素的測(cè)定方法 第4部分鐵含量的測(cè)定鄰菲啰啉法［18］進(jìn)行。

1.2.4 PSB-R 最大解磷能力檢測(cè) 分別將無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中碳源替換為果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉；氮源替換為硝酸鈉、硝酸鉀、尿素、氯化銨。搖床參數(shù)設(shè)置為28℃，140 r/min 培養(yǎng)2 d 檢測(cè)培養(yǎng)基中可溶磷含量。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過Design-Expert 13 軟件以Box-Benhnken 法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。以培養(yǎng)基中磷含量為響應(yīng)值，考察碳源濃度（A）、氮源濃度（B）、pH 值（C）不同數(shù)值組合對(duì)響應(yīng)值的影響。根據(jù)響應(yīng)面擬合方程推測(cè)PSB-R 最大解磷能力并驗(yàn)證。

1.2.5 PSB-R 溶磷能力穩(wěn)定性分析 將分離菌株以1%接種量接種至無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代10 次，檢測(cè)培養(yǎng)基上清可溶性磷含量及pH 值變化情況。

1.2.6 PSB-R 對(duì)其他難溶性磷酸鹽的溶解能力 將

1.2.4 中優(yōu)化后的無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中的磷酸三鈣替換成過磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、羥基磷灰石和氟磷灰石。每2 d 檢測(cè)培養(yǎng)基中的可溶性磷含量，使用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制折線圖。

2 結(jié)果

2.1 PSB-R鑒定結(jié)果

PSB-R 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂生長(zhǎng)的菌落形態(tài)為圓形，表面光滑，能產(chǎn)生紅色素；在無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)時(shí)不能產(chǎn)生紅色素，菌落表面粗糙，周圍有透明圈。使用結(jié)晶紫對(duì)PSB-R 進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，鏡檢顯示菌體呈藍(lán)紫色，短桿狀，大小約為0.5 μm×1.0 μm。16S rRNA 基因序列上傳至EZbiocloud 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合MEGA7.0 軟件以Neighbor-joining 方法構(gòu)建基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示PSB-R 與Serratia marcescensATCC 13880 和S.nematodiphilaDSM 21420 相似性均達(dá)到99%；平均核苷酸一致性（ANI）分析結(jié)果顯示，PSB-R 與S.marcescensGCA 004684145T 和S.marcescensATCC 13880 的ANI 數(shù)值最為接近，分別為98.88% 和98.53%。根據(jù)《伯杰氏手冊(cè)》設(shè)計(jì)生理生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示PSB-R 能夠利用多種碳源產(chǎn)酸，能夠在低溫和高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)。綜合上述實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，鑒定PSB-R 為粘質(zhì)沙雷氏菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 PSB-R 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of PSB-R

2.2 PSB-R基因組組裝結(jié)果

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)去除質(zhì)量較低的 reads，過濾得到的有效數(shù)據(jù)（Clean Data）。Clean Data 的堿基含量和質(zhì)量分布見圖2。使用GeneMarkS 對(duì)基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，基因組組裝信息與基因預(yù)測(cè)結(jié)果見表1。將PSB-R 基因組數(shù)據(jù)上傳至國(guó)家基因組數(shù)據(jù)中心，登錄號(hào)為GWHBGBR00000000。

表1 基因組裝配統(tǒng)計(jì)Table 1 Assembly statistics of genomes

圖2 堿基含量與質(zhì)量分布圖Fig.2 Base content and mass distribution map

2.3 PSB-R基因組注釋結(jié)果

使用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PSB-R 基因組進(jìn)行注釋分析，結(jié)果顯示共有4 603 條基因被注釋，共包含226條代謝通路。其中代謝途徑（metabolic pathway）注釋到基因數(shù)量最多，共有733 條基因歸屬其中；注釋基因數(shù)量占比第二的通路途徑為次級(jí)代謝產(chǎn)物合成（biosynthesis of secondary metabolites），共注釋到316 條基因。KEGG 基因組注釋結(jié)果表明，PSB-R 具有復(fù)雜的代謝途徑，并擁有多種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力。為進(jìn)一步預(yù)測(cè)PSB-R 的次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力，運(yùn)用antiSMASH 程序進(jìn)一步預(yù)測(cè)PSB-R 次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)情況，結(jié)果顯示PSB-R 具有4 種次級(jí)代謝基因簇，分別為NRPS、NRPS-like、硫肽類抗生素和β-內(nèi)脂。其中NRPS 最多，共注釋到4 條基因簇包含158 條基因。

基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋獲得數(shù)據(jù)及通路圖，分析PSB-R 基因組中解磷基因的組成情況?；虻念A(yù)測(cè)結(jié)果見表2。PSB-R 具有完整的吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）合成簇，同時(shí)具有的PQQ 依賴型葡萄糖脫氫酶基因（gcd）。除了葡萄糖脫氫酶外，PSB-R 還具有無(wú)機(jī)焦磷酸酶（ppx、ppa）、堿性磷酸酶（phoA）及有機(jī)磷水解酶（phnX）等磷酸鹽化合物降解酶的編碼基因。此外KEGG分析結(jié)果顯示，PSB-R 具有鐵載體合成的完整通路，能夠合成并分泌鐵載體。另外，KEGG 注釋顯示PSB-R 含有合成吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）所必需的ipdC 基因、幾丁質(zhì)酶編碼基因chi。

表2 促生基因預(yù)測(cè)情況Table 2 Prediction of growth-promoting genes

2.4 PSB-R最大溶磷能力檢測(cè)

對(duì)培養(yǎng)基碳源、氮源及pH 值進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。圖3-A，B 顯示以果糖作為培養(yǎng)基的碳源時(shí)PSB-R 解磷能力最強(qiáng)。在果糖濃度較低范圍內(nèi)（1%-4%）解磷能力隨果糖濃度提高不斷增強(qiáng)且差異顯著；當(dāng)果糖濃度達(dá)到較高水平（4%-10%）時(shí)，隨著果糖濃度的提高，培養(yǎng)基中可溶磷含量趨于穩(wěn)定。圖3-C，D 為氮源優(yōu)化結(jié)果?？梢钥闯雠囵B(yǎng)基中氮源為銨態(tài)氮時(shí)PSB-R 的解磷能力較強(qiáng)，為硝態(tài)氮時(shí)解磷能力較弱，而在以尿素作為氮源時(shí)可溶磷含量為0。為獲得相對(duì)最佳的氮源濃度，將培養(yǎng)基中硫酸銨濃度替換為不同濃度。從圖3-D 可看出，硫酸銨濃度在6%-8%時(shí)培養(yǎng)基中可溶磷含量處于較高水平，當(dāng)硫酸銨濃度提高到10%，可溶磷含量顯著下降。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH 值分別為4、5、6、7、8、9、10，培養(yǎng)2 d 測(cè)定可溶性磷含量（圖3-E）。結(jié)果顯示，可溶性磷含量在pH 5-10 的范圍內(nèi)與培養(yǎng)基初始pH 呈現(xiàn)反比。當(dāng)培養(yǎng)基pH 值由5 下降到4 時(shí)，可溶性磷含量降低且差異顯著（P< 0.05）。

圖3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimized results by single factor test

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以果糖濃度、硫酸銨濃度和初始pH 值作為試驗(yàn)因素，利用Design-Expert 13 軟件設(shè)計(jì)了34 組3 因素Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由F值大小可判斷出3 個(gè)因素對(duì)可溶磷含量影響的高低，從大到小依次為A（果糖濃度）>B（硫酸銨濃度）>C（pH 值）。模型P<0.000 1 表示顯著，失擬項(xiàng)F值為0.47，P值為0.500 5，表明不顯著。以上說(shuō)明該模型擬合精度較好可進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。證明多項(xiàng)式中各因素對(duì)響應(yīng)值的影響P<0.05，表明各因素對(duì)響應(yīng)值結(jié)果影響顯著。交互項(xiàng)AB，AC，BC 的P<0.05，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)各因素間均具有相互作用且對(duì)可溶性磷含量影響顯著。圖4顯示的是因素A（果糖濃度）與因素B（硫酸銨濃度）對(duì)可溶性磷含量的交互作用。相對(duì)于因素AC 與因素BC，因素AB 的曲面更陡，等高線更加密集，說(shuō)明因素A 與因素B 的交互作用對(duì)結(jié)果的影響最大。

圖4 可溶性磷含量的響應(yīng)面模型Fig.4 Response surface model of soluble phosphorus concentration

軟件分析顯示最優(yōu)結(jié)果的培養(yǎng)條件為：A=4.847 04%，B=7.304 73%，C=4.745 59，即果糖濃度4.847 04%、硫酸銨濃度為7.304 73%、pH 值為4.745 59。在該培養(yǎng)條件下，響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)可溶性磷含量為805.199 mg/L。

按照果糖濃度4.85%、硫酸銨濃度為7.31%、pH 值為4.75 配置培養(yǎng)基，測(cè)定結(jié)果顯示可溶性磷含量為807.976 mg/L，相對(duì)理論值的相對(duì)誤差為0.345%。

2.5 PSB-R溶磷能力穩(wěn)定性檢測(cè)

將PSB-R 連續(xù)傳代培養(yǎng)10 次，測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性磷含量與pH 值變化情況。從圖5可看出，PSB-R 的解磷能力較為穩(wěn)定，除第一代溶磷量為466.227 mg/L 外，后續(xù)培養(yǎng)基中可溶性磷含量均穩(wěn)定在600 mg/L 左右，培養(yǎng)基pH 值均可穩(wěn)定在4 左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，PSB-R 的解磷能力穩(wěn)定性較好，未出現(xiàn)隨著傳代次數(shù)增加而解磷能力大幅降低的現(xiàn)象。

圖5 解磷能力遺傳穩(wěn)定性分析Fig.5 Genetic stability analysis of phosphorus solubilizing ability

2.6 PSB-R對(duì)其他難溶性磷酸鹽的溶解能力

將無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中的磷酸三鈣替換為其他種類難溶性磷酸鹽。每隔2 d 對(duì)可溶性磷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6?？梢钥闯鯬SB-R 對(duì)過磷酸鈣的溶解能力明顯優(yōu)于其他4 種難溶性磷酸鹽。此外，以過磷酸鈣和羥基磷灰石作為難溶性磷酸鹽的培養(yǎng)基中可溶性磷含量的變化呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，即可溶性磷含量在上升至一定濃度后開始下降，一段時(shí)間后再次提升；磷酸鐵組在第一次測(cè)定時(shí)可溶性磷含量最高，之后逐漸降低；以氟磷灰石作為難溶性磷酸鹽的培養(yǎng)基中可溶性磷酸鹽濃度隨時(shí)間逐漸上升的趨勢(shì)；以磷酸鋁作為培養(yǎng)基磷源的實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)顯示，PSB-R對(duì)磷酸鋁溶解能力較差。

圖6 PSB-R 對(duì)其他難溶性磷酸鹽的溶解能力Fig.6 Solubility of PSB-R to other insoluble phosphates

為了確定磷酸鐵組中解磷能力的下降是否與培養(yǎng)基中鐵離子含量增高抑制細(xì)胞活性相關(guān)，測(cè)定了培養(yǎng)基中鐵離子含量的變化情況，結(jié)果如圖7所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)第5-7 天時(shí)，鐵離子濃度維持在30 mg/L 左右，鐵離子含量與可溶性磷含量的變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，證明鐵離子濃度是影響PSB-R 解磷能力的重要影響因素。

圖7 培養(yǎng)基中鐵離子含量變化情況Fig.7 Change of ferric ion content in culture medium

3 討論

據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)［19］，2020年我國(guó)人口總數(shù)已達(dá)到14.43 億人，為確保充足的糧食供應(yīng)，在過去的幾十年里，人們通過大量施加化肥的方法提高農(nóng)作物產(chǎn)量。大量施加化肥雖然能提高農(nóng)作物產(chǎn)量，但過量施用會(huì)導(dǎo)致土壤鹽堿化等多種環(huán)境問題發(fā)生并最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低。施用生物肥料來(lái)替代部分化肥能夠在確保產(chǎn)量的同時(shí)減少化肥對(duì)環(huán)境的破壞。由此看來(lái)，開發(fā)高效的生物肥料對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道的解磷菌多分離自較溫暖地區(qū)的農(nóng)田、湖泊沉積物等地［20-21］，這些地區(qū)分離出的解磷菌不適應(yīng)寒冷地區(qū)的低溫環(huán)境，施用時(shí)不能充分發(fā)揮解磷能力。因此，篩選出適合當(dāng)?shù)厣车牡蜏亍⒏咝У慕饬拙瞥缮锓柿鲜翘岣吆邶埥貐^(qū)生物肥料應(yīng)用效果的根本方法。此外，由于解磷菌多具有吸附重金屬離子，調(diào)節(jié)土壤pH 值等作用，所以施加解磷菌的生物肥料對(duì)改善黑土土壤性狀，提高黑土土壤肥力具有重要作用。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于低溫解磷菌的報(bào)道仍較少。朱德旋等［22］從佳木斯地區(qū)的寒地土壤分離出一株伯克霍爾德菌B51-7，可溶性磷含量最高為832.74 mg/L，同時(shí)能夠抑制多種植物病原菌的生長(zhǎng)；趙偉進(jìn)等［23］從西藏地區(qū)的主糧作物青稞根際分離出多株能顯著促進(jìn)青稞種子萌發(fā)和根部發(fā)育的低溫解磷菌，為西藏地區(qū)青稞微生物菌肥的研制提供了功能菌等。

本研究針對(duì)前期通過平板篩選等方法獲得一株具有較大溶磷圈的解磷菌PSB-R，通過16S RNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)合基因組ANI 分析與生理生化試驗(yàn)結(jié)果，最終鑒定PSB-R 為粘質(zhì)沙雷氏菌。沙雷氏菌是廣泛存在于土壤，水體等環(huán)境中的一類革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀，周生鞭毛具有運(yùn)動(dòng)能力，多數(shù)菌種能產(chǎn)生紅色的靈桿菌素，在多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用［24-26］?，F(xiàn)有解磷菌研究多集中于解磷能力檢測(cè)與代謝物檢測(cè)，從基因組水平針對(duì)解磷菌分子調(diào)控機(jī)制的研究仍較少。本研究采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)PSB-R 進(jìn)行基因組測(cè)序，為解磷分子調(diào)控機(jī)制的研究提供基因組數(shù)據(jù)作為研究基礎(chǔ)。除了解磷相關(guān)基因，本研究還分析預(yù)測(cè)了與解磷、鐵載體、IAA 產(chǎn)生、拮抗病原真菌等相關(guān)基因的組成情況，為探究PSB-R 其他植物促生功能提供思路參考。

為了挖掘PSB-R 作為解磷菌的應(yīng)用潛力，首先設(shè)計(jì)了響應(yīng)面試驗(yàn)以期獲取PSB-R 對(duì)磷酸三鈣的最大溶解能力，試驗(yàn)結(jié)果表明PSB-R 發(fā)揮解磷作用的前提是培養(yǎng)基的氮源必須為銨態(tài)氮，這一結(jié)論與王俊娟［10］、喬志偉等［27］的研究結(jié)果一致。喬志偉等［27］對(duì)分離出的拉恩氏菌（Rahnellasp.）在不同氮源條件下培養(yǎng)產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)解磷菌利用銨態(tài)氮與硝態(tài)氮產(chǎn)生的有機(jī)酸種類不同，并推測(cè)是造成同一解磷菌在不同氮源培養(yǎng)條件下解磷能力差異明顯的原因。王俊娟等［10］同樣認(rèn)為解磷菌在不同氮源條件下產(chǎn)酸種類不同外，還認(rèn)為解磷菌同化NH+4時(shí)釋放的H+是促進(jìn)難溶性磷酸鹽溶解的一種途徑。

其次通過多次傳代試驗(yàn)驗(yàn)證了該菌株的解磷能力穩(wěn)定情況，從培養(yǎng)基中可溶磷含量與pH 值兩個(gè)水平證實(shí)PSB-R 的解磷能力能穩(wěn)定存在10 代，未出現(xiàn)前人文獻(xiàn)描述的解磷能力衰退或丟失等現(xiàn)象。最后將磷酸三鈣替換為其他種類難溶性磷酸鹽，探究了PSB-R 對(duì)其他種類難溶性磷酸鹽的溶解情況。研究結(jié)果顯示PSB-R 對(duì)磷酸三鈣、羥基磷灰石和氟磷灰石等均具有明顯的溶解能力；對(duì)于與金屬離子結(jié)合的磷酸鹽，培養(yǎng)結(jié)果顯示以磷酸鐵作為磷源的實(shí)驗(yàn)組第一次測(cè)定時(shí)可溶磷含量高于其他種類磷源，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。推測(cè)這一現(xiàn)象可能是由于培養(yǎng)初期PSB-R 利用磷酸鐵作為磷源，培養(yǎng)基中鐵離子水平高于其他組，生長(zhǎng)速度快，溶解磷酸鐵能力較高。而隨著磷酸鐵溶解量的增高，培養(yǎng)基中鐵離子含量超過菌體生長(zhǎng)要求范圍，造成菌體生長(zhǎng)遲緩或休眠，代謝減弱，從而導(dǎo)致可溶磷含量不斷降低。為了證實(shí)這一猜想，對(duì)以磷酸鐵作為磷源的培養(yǎng)基中鐵離子濃度進(jìn)行了連續(xù)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鐵離子濃度與可溶磷含量的變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，由此認(rèn)為鐵離子濃度的增高是抑制PSB-R 解磷能力的原因。

4 結(jié)論

本研究鑒定解磷菌PSB-R 為粘質(zhì)沙雷氏菌。PSB-R 包含葡萄糖酸產(chǎn)生、磷酸鹽降解酶等解磷基因和鐵載體及幾丁質(zhì)酶等植物促生相關(guān)基因；培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)確定PSB-R 的最大解磷能力為807.976 mg/L。連續(xù)培養(yǎng)10 代，PSB-R 發(fā)酵液的pH 穩(wěn)定在4 左右，同時(shí)可溶磷含量能夠穩(wěn)定維持在600 mg/L。PSB-R 對(duì)磷酸三鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石及磷酸鐵均具有溶解能力，但鐵離子濃度大于30 mg/L 時(shí)解磷能力受到抑制。