新型冠狀病毒亞單位疫苗研制及其高效免疫增強(qiáng)劑的篩選

王祥錕 宋學(xué)宏 劉金龍 郭培紅 莊曉峰 韋良孟 周凡 張樹宇 高攀攀 魏凱

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215123；3.山東貝瑞康生物科技有限公司，濰坊 261061；4.昆山貝瑞康生物科技有限公司，昆山215345）

2019年12月，科研人員從肺炎患者中發(fā)現(xiàn)了一種新型冠狀病毒（2019-nCoV），并于2020年1月7日成功分離到毒株，該病毒引起的疾病被命名為“新型冠狀病毒感染肺炎”，其完整的基因組也已經(jīng)向全球公布［1］。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示，2019-nCoV 是一種從未見過的乙型冠狀病毒，將其列為可以感染人類的冠狀病毒科中的第7 個(gè)成員［2-4］。盡管我國(guó)新冠肺炎疫情得到了有效控制，但是目前該病毒仍在世界上幾十個(gè)國(guó)家范圍內(nèi)持續(xù)傳播，嚴(yán)重威脅著我國(guó)乃至世界人民的生命安全，對(duì)世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響。

全面防控新型冠狀病毒的感染是當(dāng)前工作的重中之重，而作為持續(xù)性防控的關(guān)鍵，疫苗、抗體和治療藥物的研發(fā)至關(guān)重要［5］。其中，疫苗的研發(fā)不僅具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，更具有戰(zhàn)略儲(chǔ)備意義。目前2019-nCoV 的全基因組序列早已經(jīng)公布，我們可以根據(jù)其基因序列預(yù)測(cè)其保護(hù)性抗原表位基因，用以研制基因工程亞單位疫苗。與傳統(tǒng)的滅活疫苗及減毒疫苗相比，基因工程亞單位疫苗更高的抗原含量和純度，且具有特異性強(qiáng)、無感染性、成本低、受限少等多方面的優(yōu)越性，對(duì)于烈性傳染病疫苗的研發(fā)是最佳的選擇［6-7］。

為了提高亞單位疫苗的免疫效果，免疫增強(qiáng)劑的篩選和配比也十分重要。免疫增強(qiáng)劑是一種能夠顯著增強(qiáng)抗原的免疫原性，能夠加快抗體產(chǎn)生的速度，提高免疫應(yīng)答的物質(zhì)。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)一種從松樹的花粉中提取的天然多糖，能夠顯著增強(qiáng)動(dòng)物疫苗（如禽流感滅活疫苗、新城疫弱毒疫苗以及多種細(xì)菌或病毒的亞單位疫苗）的免疫效果［8-12］。鑒于其優(yōu)良的免疫增強(qiáng)效果，松花粉多糖（PPPS）在人類疫苗和藥物上開發(fā)應(yīng)用具有較大的潛力。本團(tuán)隊(duì)前期開展了大量的工作，確切了PPPS作為佐劑的免疫增強(qiáng)功效［13］，但是對(duì)2019-nCoV 疫苗的免疫增強(qiáng)效果評(píng)價(jià)還需要進(jìn)行科學(xué)的驗(yàn)證。本研究成果旨在為新型冠狀病毒肺炎疫苗的研發(fā)提供技術(shù)參考和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本動(dòng)物研究由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物Q8 保護(hù)利用委員會(huì)審定（許可證號(hào)：20010510）；6周齡雌性SPF 級(jí)BALB/c 小鼠購(gòu)自于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑與設(shè)備 克隆用大腸桿菌DH5α 株、原核表達(dá)載體pET28a（+）、表達(dá)用大腸桿菌BL21 株均購(gòu)自上海生工生物有限公司；克隆載體pMD19-T、限制性內(nèi)切酶Ncol/HidIII和EcoR I/XhoI 購(gòu)自TaKaRa 公司。2019-nCoV-Spike（2019-nCoV- S）的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；2019-nCoV-Nucleocapsid（2019-nCoV- N）的基因序列由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所的叢鋒博士無償提供。泰山松花粉，每年四月采集自泰山山區(qū)，過260 目篩，并進(jìn)行超微粉碎破壁，黃芪粉購(gòu)自于藥店。羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)earthox 公司；伴刀豆素球蛋白（ConA）、胃蛋白酶、小鼠抗雞CD4-FITC 抗體和小鼠抗雞CD8-RPE 抗體購(gòu)自Amresco 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液和胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco 公司；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8 購(gòu)自索萊寶公司；ELISA 試劑盒購(gòu)自于上海朗頓生物科技公司。

高壓細(xì)胞破碎儀（北京迪索）；蛋白質(zhì)高壓制備色譜儀（法國(guó)SPOT）；Milipore 超濾系統(tǒng)（Milipore，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）。

1.2 方法

1.2.1 pET28a（+）-2019-nCoV- S 和pET28a（+）-2019-nCoV- N 表達(dá)載體的構(gòu)建 合成后的2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 基因序列，經(jīng)TA 克隆法連接至pMD19-T 載體，送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序鑒定。將測(cè)序鑒定正確的2019-nCoV- S和2019-nCoV- N 目的片段，分別經(jīng)Ncol/HidIII和EcoR I/XhoI 雙酶切后，插入表達(dá)載體pET28a（+）質(zhì)粒，分別獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）-2019-nCoV- S 和pET28a（+）-2019-nCoV- N。

1.2.2 2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將表達(dá)載體pET28a（+）-2019-nCoVS 和pET28a（+）-2019-nCoV- N 分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)物按1∶100 的比例接種到2YT 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（卡那霉素終濃度100 μg/mL）中，37℃條件下，220 r/min 振蕩培養(yǎng)2 h 后，在培養(yǎng)物中加入IPTG 至終濃度1 mmol/L，28℃，100 r/min培養(yǎng)4 h；離心收集細(xì)胞，進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析。

誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a（+）-2019-nCoV- S/ BL21和pET28a（+）-2019-nCoV- N/ BL21 經(jīng)高壓細(xì)胞破碎儀破碎，4℃條件下12 000 r/min 離心10 min，收集沉淀；將沉淀分別用含7 mol/L 尿素的變性緩沖液充分溶解；4℃條件下12 000 r/min 離心20 min，得上清液；親和層析柱進(jìn)行純化；用Milipore 超濾系統(tǒng)將洗脫液進(jìn)行超濾濃縮和脫鹽處理，直至洗脫液中不含咪唑及尿素；整個(gè)操作在4℃條件下進(jìn)行。最終獲得純化2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 重組蛋白，采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3 PPPS 的制備 按照Wei 等［11］優(yōu)化的步驟進(jìn)行PPPS 的提取。將破壁的松花粉用濾紙分裝成數(shù)包（50 g/包）并放入索氏提取器中，用乙醚抽提脂肪。將去除脂肪的花粉與去離子水混合（1∶15）放置于水浴鍋中，使其在85℃浸提8 h。將反應(yīng)后的松花粉懸液冷卻后放置于4℃冰箱中沉淀過夜，棄去沉淀，用濾網(wǎng)過濾上清，再離心上清（10 000 r/min,10 min），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加壓濃縮。將濃縮液用Sevag試劑除蛋白，重復(fù)2 次，最后用4 倍體積的無水乙醇沉淀多糖，冷凍干燥后得到PPPS。黃芪粉從藥店購(gòu)買，遵循相同的方法提取黃芪多糖（APS），跳過除脂步驟。

1.2.4 疫苗的制備 重組表達(dá)2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 蛋白分別與不同濃度的PPPS 按照相應(yīng)的體積比混合后加入到組織搗碎機(jī)進(jìn)行混勻，多糖終濃度分別為200、400、800 mg/mL。本試驗(yàn)免疫程序計(jì)劃分3 次免疫，每次免疫時(shí)各組疫苗中多糖含量不變，重組蛋白含量梯度增加，分別為50、100 和150 μg/mL。對(duì)照組按照終濃度400 mg/mL 的APS 劑量分別與2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 蛋白調(diào)配后用組織搗碎機(jī)進(jìn)行混合均勻，3 次免疫的蛋白濃度也為50、100 和150 μg/mL。

1.2.5 免疫程序 將100 只小鼠分為兩大組：A 組為2019-nCov-S 組，然后再分為5 個(gè)小組（I-V 組），每個(gè)小組10 只小鼠。I 組：低劑量松花粉多糖組（LPPPS 組）免疫200 mg/mL PPPS-2019-nCoV-S 疫苗，II 組：中劑量松花粉多糖組（MPPPS 組）免疫400 mg/mL PPPS-2019-nCoV-S 疫苗，III 組：高劑量松花粉多糖組（HPPPS 組）免疫800 mg/mL PPPS-2019-nCoV-S 疫苗，IV 組免疫APS-2019-nCoV- S 疫苗，V 組僅免疫純化的加PBS 的2019-nCoV- S 疫苗。B 組為2019-nCoV- N 組，5 個(gè)小組分組設(shè)置與2019-nCoV- S 組相同。各組分別免疫3 次，每次間隔兩周；第一次免疫2019-nCoV-S 和2019-nCoV-N 蛋白含量為50 μg/mL，第二次免疫蛋白劑量為100 μg/mL，第三次蛋白劑量為150 μg/mL。免疫方式均為腿部肌肉注射。在第一次免疫后的3、7、14、21、28、35 d采集血液，分離血清，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.6 PPPS 佐劑2019-nCoV 亞單位疫苗免疫后特異性IgG 抗體的測(cè)定 用間接ELISA 試驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠血清中2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 特異性IgG的抗體滴度，步驟如下：包被：每孔分別100 μL 0.5 μg/mL 2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 蛋白，4℃包被12 h 后PBST 清洗3 次，間隔5 min。封閉：每孔加入200 μL 封閉液（含1% BSA 的PBST），37℃水浴2 h，PBST 清洗3 次。一抗孵育：使用2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 多抗小鼠血清作為一抗，使用封閉液稀釋免疫疫苗后的各組血清，每孔100 μL，37℃水浴2 h，PBST 清洗5 次；二抗孵育：每孔加入100 μL 羊抗鼠酶標(biāo)二抗（IgG，1∶10 000 稀釋），37℃水浴1 h，PBST 清洗6 次；顯色：每孔加入100 μL TMB 顯色液，37℃水浴避光顯色5 min；終止：每孔加入50 μL 終止液（2 mol/L H2SO4）；讀數(shù)：樣品吸光度（OD490nm）使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 PPPS 佐劑2019-nCoV 亞單位疫苗免疫后對(duì)小鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫的影響

1.2.7.1 血清IL-2 含量的檢測(cè) 血清IL-2 含量的檢測(cè)按照小鼠IL-2 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7.2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定 小鼠尾根靜脈采集肝素鈉抗凝血0.5 mL，加入等體積的全血稀釋液。取無菌的2 mL 離心管，向其中加入1 mL 淋巴細(xì)胞分離液，用巴氏德吸管將血液稀釋液平鋪到分離液液面上方，保持兩液界面清晰。將離心管放置于水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)中，3 000 r/min，25 min。離心后，用微量加樣器吸取中間層乳白色霧狀的淋巴細(xì)胞于無菌的10 mL 離心管中，加入5 mL 細(xì)胞洗滌液，1 500 r/min，10 min。傾斜緩慢倒掉上清，加入5 mL PBS 緩沖液，1 500 r/min，10 min，此過程重復(fù)2 次。倒掉上清，用含10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，每組6 孔，周圍加入RPMI-1640 邊緣對(duì)照孔。6 孔中3 孔加入25 μL ConA，并放置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48 h，到時(shí)向每孔中加入10 μL CCK-8，繼續(xù)放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2-4 h，通過酶標(biāo)儀測(cè)定其在490 nm 處的吸光值。根據(jù)公式計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率：LTR=（ConA刺激OD490nm均值-無ConA 刺激OD490nm均值）/對(duì)照組OD490nm均值。

1.2.8 PPPS 佐劑2019-nCoV 亞單位疫苗免疫后外周血CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞的測(cè)定 采集新鮮肝素鈉抗凝血1 mL，加入等體積的全血稀釋液得到2 mL的稀釋血液。小心的將上述稀釋血液加到2 mL 淋巴細(xì)胞分離液的液面上，要求同1.2.7.2 步驟。取乳白色霧狀的淋巴細(xì)胞層，取2 mL 分別置于兩個(gè)管中。加PBS 至2 mL 刻度，1 500 r/min，10 min。棄上清，重復(fù)兩次。500 μL PBS 重懸沉淀，取50 μL。每樣加20 μL 染料（小鼠抗雞CD4-FITC 和小鼠抗雞CD8-RPE 各10 μL）。4℃避光孵育20 min，上樣，用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 2019-nCoV- S和2019-nCoV- N重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖1-A 顯示，構(gòu)建成功的pET28a（+）-2019-nCoVS/BL21 克隆株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，蛋白電泳圖在53 kD與70 kD 之間顯示出較粗的條帶（泳道2 和泳道4），與預(yù)測(cè)大小55.68 kD 吻合；pET28a（+）-2019-nCoVN/BL21 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在40-53 kD 顯示出較粗的條帶（泳道6 和泳道8），與預(yù)測(cè)大小45.64 kD吻合。

圖1-B 和圖1-C 顯示，經(jīng)Ni-NTA 親和層析柱純化后的pET28a（+）-2019-nCoV-S/BL21 和pET28a（+）-2019-nCoV-N/BL21 重組蛋白純度可達(dá)90%以上。

圖1 2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化Fig.1 Induced expressions and purifications of recombinant protein 2019-nCoV-S and 2019-nCoV-N

純化蛋白濃度測(cè)定：按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定，以吸光度OD562nm為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA 含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。經(jīng)計(jì)算，Ni-NTA 純化后的2019-nCoV- S 重組蛋白濃度為1.12 mg/mL，共得到重組蛋白17.2 mg；2019-nCoV- N 重組蛋白濃度為0.66 mg/mL，共得到重組蛋白10 mg。

圖2 BSA 蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 BSA protein concentration determination standard curve

2.2 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后對(duì)特異性IgG抗體的測(cè)定結(jié)果

制備的2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 亞單位疫苗免疫后小鼠血清中抗體效價(jià)的變化示于圖3。單純的兩種重組蛋白（PBS 組）免疫后抗體效價(jià)從14 d 開始升高，但總體上升緩慢，而LPPPS 組、MPPPS 組、HPPPS 組的抗體滴度均快速升高，顯著高于PBS 組（P< 0.05）；在免疫后14-35 d，MPPPS組的抗體效價(jià)極顯著高于PBS 組（P< 0.01）；在第35 天，所有組的抗體效價(jià)達(dá)到峰值。其中，MPPPS組的抗體效價(jià)從14-35 d 均為最高，表明400 mg/mL PPPS 作為佐劑增強(qiáng)了2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N誘導(dǎo)的IgG 抗體應(yīng)答。

圖3 疫苗免疫后特異性IgG 抗體的測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination of specific IgG antibody after immunization with vaccine

2.3 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后血清IL-2檢測(cè)結(jié)果

如圖4所示，于第一次免疫后的第28-35 天，細(xì)胞因子IL-2 的變化趨勢(shì)基本與抗體變化保持規(guī)律一致，其中MPPPS 組的IL-2 含量顯著（P< 0.05）高于APS 組、LPPPS 組、HPPPS 組和PBS 組，說明400 mg/mL 的PPPS 有效地提高了兩種亞單位疫苗免疫后小鼠的血清中IL-2 含量。

圖4 疫苗免疫后血清中IL-2 的含量變化Fig.4 Changes of IL-2 content in serum after immunization with vaccine

2.4 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率測(cè)定結(jié)果

各組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率變化結(jié)果見圖5。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率反映了小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。在第一次疫苗接種3-35 d 后，無論是2019-nCoV- S 還是2019-nCoV- N 亞單位疫苗，MPPPS 佐劑組T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率均高于APS 組、LPPPS 組、HPPPS 組和PBS 組。第28 天，T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率所有組達(dá)到高峰值。結(jié)果表明，400 mg/mL 的PPPS 有效地提高了兩種亞單位疫苗免疫后小鼠的T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率。

圖5 疫苗免疫后外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率的變化Fig.5 Changes of peripheral blood lymphocyte conversion rate after immunization with vaccine

2.5 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果

各免疫組外周血CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞含量變化示于圖6。無論是2019-nCoV- S 還是2019-nCoV- N 亞單位疫苗免疫，MPPPS 佐劑組外周血CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞含量高于APS 組、LPPPS組、HPPPS 組和PBS 組。在免疫后3-28 d，外周血CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞含量逐漸升高，并在第28 天達(dá)到峰值，28-35 d 有所下降。以上結(jié)果表明，400 mg/mL 的PPPS 有效地提高了兩種亞單位疫苗免疫后小鼠的外周血CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞含量。

圖6 疫苗免疫后外周血CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞含量的測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination of CD4+T and CD8+T cell content in peripheral blood after immunization with vaccine

3 討論

2019年底全球爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎疫情，世界衛(wèi)生組織迅速將其定為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件［14］，全球疫情防控壓力巨大，因此迫切需要新的預(yù)防與治療方法，以有效遏制2019-nCoV 的快速傳播。亞單位疫苗是以合成肽或重組蛋白為基礎(chǔ)制備的疫苗，與滅活或減毒病毒和一些活病毒載體疫苗不同，這種疫苗包含了高濃度的病毒保護(hù)性抗原片段，但不包括傳染性病毒粒子，既能夠產(chǎn)生高度特異性的抗體，又消除了滅活不完全、毒力恢復(fù)或前期免疫抗體存在干擾的風(fēng)險(xiǎn)［15-16］。亞單位疫苗通常是安全的，不會(huì)引起潛在的負(fù)面免疫反應(yīng)，然而，這些亞單位疫苗可能會(huì)面臨一些重要的挑戰(zhàn)，主要是因?yàn)樗鼈兊拿庖咴韵鄬?duì)較低，必須與適當(dāng)?shù)淖魟┡浜?，因此高效免疫佐劑的篩選十分重要。

多糖是一種高分子量的碳水化合物，代表著一類主要來源于微生物、動(dòng)物或植物的生物活性分子，具有多種生理功能，增強(qiáng)和激活巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌［17］。作為疫苗佐劑，多糖不僅可以促進(jìn)抗原特異性免疫系統(tǒng)，還可以增強(qiáng)機(jī)體的天然免疫功能［18-19］。許多植物多糖，特別是從中草藥中提取的多糖，已經(jīng)成為取代傳統(tǒng)佐劑的極佳候選物質(zhì)，因?yàn)橹参锒嗵强梢源碳っ庖呦到y(tǒng)從而增強(qiáng)免疫力，比細(xì)菌多糖和合成化合物毒性小，副作用少［20-21］。目前，商品化的APS已被添加到口蹄疫病毒、傳染性法氏囊病毒、禽流感病毒等疫苗中，且顯示出良好的佐劑能力［22-23］。本實(shí)驗(yàn)室一直從事PPPS 佐劑的研究，前期研究表明，PPPS 對(duì)多種動(dòng)物疫苗具有顯著的免疫增強(qiáng)作用［24-26］，但是對(duì)于新型冠狀病毒疫苗的效果尚未驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，PPPS 不論作為2019-nCoV-S還是2019-nCoV- N 重組蛋白的佐劑，均能夠顯著提高二者誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，且效果優(yōu)于同劑量的APS。盡管PPPS 的提取總成本高于APS，但是人用疫苗優(yōu)先考慮效果，因此PPPS 具有成為新型疫苗佐劑的較大潛力。

接種疫苗后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)高低是評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效果的主要標(biāo)準(zhǔn)。從本研究結(jié)果來看，APS佐劑雖然可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)2019-nCoV 的免疫反應(yīng)，但同劑量的PPPS 效果優(yōu)于APS，并且400 mg/mL 劑量的PPPS 能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更高效價(jià)的抗體，因此，PPPS 佐劑會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的保護(hù)效果。IL-2 是效應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖或分化和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞增殖或分化所必需的多效性細(xì)胞因子，有抗感染活性［27］。相比APS 佐劑和PBS 對(duì)照組，400 mg/mL 劑量的PPPS 顯著提高了血清中IL-2 的含量，因此PPPS 佐劑具有更強(qiáng)的抗感染促進(jìn)作用。T 淋巴細(xì)胞是獲得性免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，廣泛參與從信號(hào)識(shí)別、抗原提呈，到炎癥因子的釋放、其他免疫細(xì)胞的激活和趨化等多個(gè)免疫反應(yīng)過程［28］。淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化率和T 細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+）數(shù)量是反映T 細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)［29］。在本研究中，400 mg/mL 劑量的PPPS 能夠顯著提高機(jī)體的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和CD4+、CD8+T 細(xì)胞含量，且效果均優(yōu)于其他各組，表明PPPS 能夠顯著提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，這一點(diǎn)對(duì)于疫苗佐劑來講非常重要，這是因?yàn)楹芏嘁呙缌己玫拿庖弑Ｗo(hù)需要較強(qiáng)的細(xì)胞免疫，尤其是殺傷性T細(xì)胞（CD8+T 細(xì)胞）介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本試驗(yàn)重組表達(dá)了兩種2019-nCoV抗原蛋白用于制作亞單位疫苗，并評(píng)價(jià)了不同濃度PPPS對(duì)兩種2019-nCoV亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用。通過測(cè)定各組小鼠的相關(guān)免疫指標(biāo)，證明了PPPS能夠顯著提高兩種亞單位疫苗的免疫效果，改善機(jī)體的免疫功能。因此，PPPS 的優(yōu)良特性使其可以作為2019-nCoV 亞單位疫苗的候選佐劑，從而為新型2019-nCoV 亞單位疫苗的研發(fā)提供理論和技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）-2019-nCoV-S 和pET28a（+）-2019-nCoV- N，轉(zhuǎn)入E.coliBL21 之后誘導(dǎo)表達(dá)出了大小分別約為55.68 kD 和45.64 kD 的重組蛋白2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N。分別制備了含不同濃度PPPS 佐劑的重組蛋白2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 亞單位疫苗，結(jié)果顯示，疫苗免疫小鼠后TPPS 佐劑可以提高抗體效價(jià)、血清中IL-2 含量、外周血CD4+T 與CD8+T含量以及T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，證明PPPS 對(duì)疫苗的免疫效果有顯著的提升效果，可以作為2019-nCoV亞單位疫苗佐劑的候選。