鋁佐劑的作用機(jī)制研究進(jìn)展

聞曉波，張玲玲，冉旭華

鋁佐劑的作用機(jī)制研究進(jìn)展

聞曉波，張玲玲，冉旭華?

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

隨著亞單位疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗的出現(xiàn)，免疫佐劑的研究也逐漸得到人們關(guān)注，鋁佐劑作為唯一被應(yīng)用于人用疫苗的佐劑，其作用機(jī)制尚未完全明確。隨著研究的深入，早期的部分理論也面臨諸多質(zhì)疑。本文結(jié)合近年來(lái)對(duì)鋁佐劑自身性質(zhì)、作用機(jī)制等研究數(shù)據(jù)進(jìn)行論述，以求促進(jìn)對(duì)鋁佐劑作用機(jī)制的深入了解和應(yīng)用。

佐劑；鋁佐劑；作用機(jī)制；聯(lián)合佐劑；納米顆粒

疫苗佐劑是一類能夠非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑不但能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期、高效的特異性免疫應(yīng)答從而提高疫苗的效力延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的保護(hù)時(shí)間；同時(shí)還能減少抗原用量、降低生產(chǎn)成本以及減少免疫接種次數(shù)。1920年，法國(guó)巴斯德研究所Ramon發(fā)現(xiàn)注射部位的膿腫有助于提高特異性抗體滴度。為了驗(yàn)證這種假設(shè)，他在滅活的毒素中添加淀粉或者面包屑等物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)能夠在注射部位誘生炎癥的物質(zhì)可以提高抗體的產(chǎn)量。1926年，Glenny最先將明礬作為佐劑應(yīng)用于白喉類毒素疫苗，為鋁佐劑（如氫氧化鋁、磷酸鋁）的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[1-2]。

鋁鹽佐劑作為世界范圍內(nèi)唯一批準(zhǔn)用于人用疫苗的佐劑，已經(jīng)在世界各國(guó)廣泛使用了80余年，然而關(guān)于鋁佐劑作用機(jī)制的研究仍然較少，闡明佐劑是如何激活或者調(diào)解免疫應(yīng)答的機(jī)制，將有助于疫苗開(kāi)發(fā)。根據(jù)抗原的種類和病原體保護(hù)性免疫應(yīng)答的類型，選擇合適的免疫佐劑來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳的保護(hù)性免疫應(yīng)答，可以達(dá)到預(yù)防或者治療疾病的目的。已有文獻(xiàn)綜述對(duì)于鋁佐劑的作用機(jī)制進(jìn)行了闡述[3]，相同部分，本文不再贅述，本文主要針對(duì)有關(guān)鋁佐劑的性質(zhì)、作用機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)及鋁佐劑的改進(jìn)措施進(jìn)行闡述，為含鋁佐劑疫苗的研發(fā)和設(shè)計(jì)提供些許指導(dǎo)。

1 氫氧化鋁的理化性質(zhì)

鋁佐劑通常指氫氧化鋁（aluminum hydroxide）和磷酸鋁（aluminum phosphate）。氫氧化鋁以4.5 nm× 2.2 nm×10 nm的纖維狀粒子形式存在[4]，等電點(diǎn)為11.4[5]。在化學(xué)組成上，以鋁羥基形式存在，其羥基可以提供或接受質(zhì)子，從而表現(xiàn)為兩性化合物，在pH 7.4的溶液中帶正電荷，是帶負(fù)電荷抗原的良好吸附劑[6]。研究表明，在pH為7.4、25℃的條件下，朗繆爾吸附等溫線上顯示，氫氧化鋁對(duì)于類毒素的吸附能力高達(dá)283μg/mg Al，而吸附系數(shù)則高達(dá)1.3×104mL/μg；而相同條件下磷酸鋁對(duì)類毒素的吸附能力僅為3μg/mg Al，吸附系數(shù)也僅有0.2 mL/μg[7]。當(dāng)氫氧化鋁pH與組織液pH相近時(shí)，有較好的儲(chǔ)存功能，對(duì)酸性蛋白質(zhì)的吸附效果較好，但對(duì)堿性蛋白的吸附率低。通過(guò)將氫氧化鋁佐劑磷酸化處理可降低其等電點(diǎn)，提高對(duì)堿性蛋白的吸附率，也可通過(guò)修飾抗原磷酸化程度來(lái)提高對(duì)堿性蛋白吸附率。Rinella等[8]通過(guò)5 mmol/L磷酸根離子處理氫氧化鋁佐劑使其吸附溶菌酶的能力提高了3倍。所以，可以根據(jù)抗原的等電點(diǎn)，通過(guò)選擇氫氧化鋁或者對(duì)其進(jìn)行磷酸化處理，從而達(dá)到最佳的吸附效果，氫氧化鋁佐劑的這個(gè)特點(diǎn)，使其在疫苗制備過(guò)程中較磷酸鋁應(yīng)用更加廣泛，所以本文著重介紹氫氧化鋁佐劑的免疫機(jī)制。

鋁佐劑的吸附能力強(qiáng)，可增強(qiáng)疫苗的抗原性，過(guò)去認(rèn)為鋁佐劑的作用機(jī)制與其具有的抗原吸附能力有關(guān)，但含有鋁佐劑的疫苗經(jīng)冷凍后效價(jià)會(huì)明顯降低。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)含鋁佐劑乙肝疫苗經(jīng)冷凍后，尤其經(jīng)-10℃以下低溫冷凍處理，佐劑-抗原粒子發(fā)生聚集、抗原結(jié)構(gòu)受損、免疫原性降低。所以，添加了鋁佐劑的疫苗，應(yīng)在2～8℃條件下保存或運(yùn)輸；若因低溫導(dǎo)致疫苗冰凍，根據(jù)WHO的指導(dǎo)原則，這樣的疫苗應(yīng)該予以廢棄，這是含鋁鹽類佐劑的缺陷之一。

2 鋁佐劑的作用機(jī)制

2.1 抗原儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)氫氧化鋁佐劑能夠?qū)⒖扇苄钥乖皆谧魟┑谋砻妫龃罂乖谋砻娣e，將抗原提呈給免疫細(xì)胞并促使抗原和免疫細(xì)胞間的相互作用，這種功能稱之為儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)。鋁佐劑可通過(guò)靜電力、輸水（or疏水）作用及其表面的羥基與抗原分子上的磷酸基團(tuán)發(fā)生配基交換來(lái)吸附抗原，從而達(dá)到緩慢釋放抗原、提高局部抗原濃度的作用。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，人們認(rèn)為鋁佐劑的儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)是其發(fā)揮佐劑功能的主要因素之一[9]，然而最近的研究結(jié)果顛覆了人們的認(rèn)知。Hutchison等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，抗原和鋁佐劑注射到機(jī)體2 h后，將注射位點(diǎn)去除，對(duì)抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞免疫應(yīng)答無(wú)影響。Gupta等[11]將破傷風(fēng)類毒素以14C標(biāo)記后，吸附到氫氧化鋁佐劑上，發(fā)現(xiàn)破傷風(fēng)類毒素注入小鼠體后立刻與佐劑發(fā)生解離。在間質(zhì)液中，大多數(shù)抗原都會(huì)快速地與佐劑發(fā)生解離進(jìn)入組織液中。Iyer等[12]的研究中，以含有卵清蛋白、α-酪蛋白及脫磷酸化的α-酪蛋白的鋁佐劑疫苗作為疫苗模型，發(fā)現(xiàn)吸附于佐劑上的卵清蛋白和去磷酸化的α-酪蛋白在暴露于間質(zhì)液4 h時(shí)，抗原和佐劑完全解離，但其免疫效果仍好于單純的無(wú)佐劑抗原疫苗。

Hansen等[13]使用含氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑的HIV-1 SF162dV2gp140（gp140）抗原研究吸附強(qiáng)度對(duì)抗原免疫原性的影響。研究中采用磷酸二氫鉀處理得到不同吸附強(qiáng)度的氫氧化鋁佐劑，結(jié)果表明，佐劑與抗原之間的吸附強(qiáng)度與免疫反應(yīng)無(wú)相關(guān)性，尤其在抗原含量較低時(shí)，往往當(dāng)佐劑的吸附強(qiáng)度太高時(shí)，免疫應(yīng)答水平反而降低。乙肝疫苗也有類似結(jié)論的報(bào)道，不同吸附量的鋁佐劑乙肝疫苗，抗體反應(yīng)強(qiáng)度與吸附強(qiáng)度呈反比[14]。綜上所述，不能通過(guò)測(cè)量鋁佐劑與疫苗抗原之間的吸附強(qiáng)度來(lái)預(yù)測(cè)含鋁佐劑的疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平。

2.2 促進(jìn)吞噬和T T細(xì)胞分化Mannhalter等[15]比較了氫氧化鋁佐劑在巨噬細(xì)胞吞噬125I標(biāo)記的白喉類毒素上的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在類毒素與巨噬細(xì)胞孵育10 min～6 h時(shí)間范圍內(nèi)，在氫氧化鋁佐劑存在的情況下，巨噬細(xì)胞攝取白喉類毒素的速度至少可以提高5倍以上，這也證明了氫氧化鋁具有較好的促吞噬效應(yīng)。另外，Rimaniol等[16]通過(guò)體外試驗(yàn)研究了氫氧化鋁佐劑與巨噬細(xì)胞的相互作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)巨噬細(xì)胞吞噬氫氧化鋁后，細(xì)胞的表型和功能發(fā)生改變，與髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞更為相似，可以誘導(dǎo)MHC-II類抗原特異性免疫記憶應(yīng)答反應(yīng)。Mannhalter等[15]研究證明含有氫氧化鋁佐劑的破傷風(fēng)類毒素可以使T細(xì)胞釋放更多的IL-1，而IL-1反過(guò)來(lái)可以刺激T細(xì)胞分化增殖，也就間接證明了加有氫氧化鋁佐劑的疫苗可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答水平。

2.3 NLRP NLRP33炎性體研究發(fā)現(xiàn)，氫氧化鋁可活化NLRP3（Nucleotide binding oligomerization domain（NOD）like receptor protein 3，NLRP3，也稱作NALP3）。NLRP3作為NOD樣受體家族的成員之一，可以通過(guò)caspase激活和募集結(jié)構(gòu)域（caspase activation and recruitment domain（CARD））進(jìn)行寡聚化，CARD與天冬氨酸蛋白酶1相互作用形成炎性體，并修飾促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的前體分子，使之為成熟的IL-1β和IL-18[15，17]。隨著氫氧化鋁顆粒以內(nèi)吞形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后產(chǎn)生活性氧，在這一過(guò)程中溶酶體膜也遭受一定的損傷?；钚匝鹾腿苊阁w損傷都是NLRP3炎性體的上游激活信號(hào)；而氫氧化鋁佐劑介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，釋放尿酸。組織間隙局部高濃度的尿酸形式尿酸鹽晶體形成內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)（endogenous danger signals）或則損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），間接激活NLRP3炎性體的形成[18]。因直接因素和間接因素形成的NLRP3炎性體，可以刺激炎性樹(shù)突狀細(xì)胞，從而促進(jìn)抗原的攝取、加工和遞呈，調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答，以此發(fā)揮佐劑活性。

關(guān)于鋁佐劑的佐劑活性是否依賴于NLRP3炎性體的形成，不同的研究小組給出了不同的答案。例如，Eisenbarth等[18]和Li等[19]認(rèn)為鋁佐劑所誘導(dǎo)的NLRP3炎性體是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性所必須的；但是Franchi等[20]的試驗(yàn)認(rèn)為NLRP3炎性體在鋁佐劑所介導(dǎo)的IL-1β分泌上是至關(guān)重要的，但是對(duì)于鋁佐劑的免疫調(diào)節(jié)活性不是必須的。不同的研究小組產(chǎn)生沖突性結(jié)論的原因是多方面的，例如不同研究小組在研究佐劑活性的模型不是標(biāo)準(zhǔn)化的，包括疫苗配方、鋁佐劑的吸附系數(shù)、抗原和佐劑劑量、抗原純度、免疫途徑和免疫程序、試驗(yàn)動(dòng)物品系和遺傳背景以及試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)量方法等。另外需要指出的是，某些研究小組使用Imjet?Alum（氫氧化鋁和氫氧化鎂的1:1混合物）來(lái)研究鋁佐劑的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[18-19]。嚴(yán)格意義上講，Imjet?Alum不是鋁佐劑，其不能用于人用疫苗的生產(chǎn)。Imjet?Alum中的氫氧化鎂在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面起到何種作用尚不可知。除了上述因素之外，無(wú)論是商品化的氫氧化鋁還是磷酸鋁，不同批次的產(chǎn)品在佐劑黏度、顆粒直徑上均存在著較大的差異，而這兩個(gè)參數(shù)是影響鋁佐劑的佐劑活性的重要指標(biāo)。所以，在對(duì)試驗(yàn)研究中的模型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之前，尚無(wú)法定性NLRP3炎性體與鋁佐劑的免疫調(diào)節(jié)活性之間的關(guān)系。

2.4 宿主細(xì)胞DNA DNA釋放細(xì)胞死亡后釋放出大量的細(xì)胞內(nèi)容物，可以作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)或者DAMPs，通過(guò)PRR信號(hào)途徑來(lái)激活先天性免疫應(yīng)答[21]。鋁佐劑具有一定的細(xì)胞毒性，含鋁佐劑疫苗導(dǎo)致注射部位細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞死亡所釋放的宿主雙鏈DNA可以作為內(nèi)源性免疫刺激信號(hào)來(lái)介導(dǎo)鋁佐劑的免疫調(diào)節(jié)活性[22]。宿主DNA可以通過(guò)IRF3（interferon response factor 3）非依賴的機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)初級(jí)B細(xì)胞應(yīng)答和產(chǎn)生IgG1；另外宿主DNA可以通過(guò)IRF3依賴的機(jī)制來(lái)激活Th2細(xì)胞應(yīng)答[22]。另外研究證實(shí)，宿主DNA可以提高M(jìn)HC-II介導(dǎo)的抗原提呈，并且可以促進(jìn)CD4 T細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞之間的相互作用[23]。所以，含鋁佐劑的細(xì)胞毒性所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡及宿主細(xì)胞DNA的釋放，從某種意義上來(lái)講又一次起到了免疫佐劑的作用。

2.5 其他作用機(jī)制含鋁佐劑除了可以通過(guò)NLRP3依賴的信號(hào)通路來(lái)分泌IL-1β和IL-18等炎性細(xì)胞因子外，鋁佐劑還可以通過(guò)壞死細(xì)胞所釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)激活炎癥反應(yīng)[24]。最近的研究發(fā)現(xiàn)從壞死細(xì)胞內(nèi)釋放的IL-33可以作為一種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)；更重要的是，IL-33與鋁佐劑可以誘導(dǎo)相似的細(xì)胞因子表達(dá)譜，包括IL-5、IL-6、IL-13、MCP-1α、MCP-1β等。此外，IL-33與抗原混和后免疫動(dòng)物，可以產(chǎn)生抗原特異性抗體，表明IL-33本身也具有佐劑活性[24]。但是IL-33與鋁佐劑相比，其所誘導(dǎo)的抗體動(dòng)態(tài)變化存在一定差異，鋁佐劑可以誘導(dǎo)較高的IgM抗體滴度，免疫后10 d達(dá)到最高值；在抗原加強(qiáng)免疫后，IL-33所誘導(dǎo)的IgM抗體滴度持續(xù)性上升，而鋁佐劑免疫組IgM滴度則持續(xù)降低。另外，在免疫后10、17、21 d，鋁佐劑所誘導(dǎo)的IgG1水平均高于IL-33免疫組。需要指出的是，鋁佐劑所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答是不依賴于IL-33的。

Ramanathan等[25]發(fā)現(xiàn)鋁鋯混合物通過(guò)凝集素途徑激活補(bǔ)體，但Arvidsson等[26]的研究卻認(rèn)為鋁分子通過(guò)經(jīng)典途徑與C3分子結(jié)合。最近Guven等[27]發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁佐劑可以通過(guò)3個(gè)途徑激活補(bǔ)體，但主要是通過(guò)旁路途徑。鋁佐劑可以通過(guò)補(bǔ)體激活途徑，來(lái)激活局部的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性細(xì)胞到達(dá)抗原注射部位攝取和加工抗原，將先天性免疫和獲得性免疫聯(lián)系起來(lái)，這可能也是鋁佐劑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的機(jī)制之一。

3 傳統(tǒng)鋁佐劑的改進(jìn)措施

3.1 聯(lián)合佐劑盡管氫氧化鋁佐劑疫苗已經(jīng)應(yīng)用了80多年，其在人類及動(dòng)物疫病防控上起到了相當(dāng)重要的作用，但是氫氧化鋁佐劑疫苗主要誘導(dǎo)Th2型體液免疫應(yīng)答，而誘導(dǎo)Th1類免疫應(yīng)答的能力較弱，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的病原體的免疫防制效果不佳，如結(jié)核分枝桿菌、李斯特氏菌、HBV和HPV等。另外，鋁佐劑在年長(zhǎng)者及免疫缺陷人群中的免疫調(diào)節(jié)效力較差[28]。為了克服鋁佐劑疫苗的缺陷，科學(xué)家們?cè)阡X佐劑疫苗的基礎(chǔ)上，添加其他成分，即開(kāi)發(fā)聯(lián)合佐劑以提高疫苗的免疫效力。例如，葛蘭素史克（GlaxoSmithKline）開(kāi)發(fā)的新型AS04佐劑，其是在鋁佐劑的基礎(chǔ)上添加沙門氏菌LPS的衍生物單磷酰脂質(zhì)A（3-deacyl-monophosphoryl lipid A）。AS04佐劑可以誘導(dǎo)局部NF-κB的活性及瞬時(shí)細(xì)胞因子分泌，提高注射部位附近淋巴結(jié)內(nèi)的抗原特異性樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞的活化。目前AS04佐劑用于人乳頭瘤病毒疫苗（Cervarix?）和新型乙型肝炎疫苗（Fendrix?）。另外，在鋁佐劑中添加CpG佐劑也可以提高佐劑的免疫調(diào)節(jié)效力，例如在重組乙型肝炎表面抗原疫苗中添加BCG-CpG-DNA可以提高抗原特異性Ig2a的產(chǎn)量，表明其可以誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答[29]。已有研究證明，CpG ODN與氫氧化鋁聯(lián)合佐劑可誘發(fā)高水平的免疫應(yīng)答，比單純使用鋁佐劑更有優(yōu)勢(shì)[30]。盡管隨著聯(lián)合佐劑的研究日益增多，彌補(bǔ)了單純應(yīng)用鋁佐劑的某些不足，然而不同種類聯(lián)合佐劑的免疫增強(qiáng)作用相差較大。即使是同一聯(lián)合佐劑，佐劑劑量和佐劑/抗原比例的小量變化將可能改變免疫應(yīng)答的類型。因此，進(jìn)行聯(lián)合佐劑研究時(shí)，還需通過(guò)多種參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)來(lái)評(píng)判聯(lián)合佐劑免疫效果的優(yōu)劣。

3.2 制備鋁佐劑納米顆粒除了應(yīng)用聯(lián)合佐劑的來(lái)提高鋁佐劑的免疫調(diào)節(jié)效果外，近年來(lái)的免疫研究表明，鋁佐劑的納米顆粒可以極大地提高佐劑的效力。與傳統(tǒng)鋁佐劑相比，納米顆粒具有更大的表面積、更大的吸附能力。在水溶液中，傳統(tǒng)鋁佐劑（氫氧化鋁或者磷酸鋁）形成1～20μm的顆粒物，而納米顆粒的直徑小于200 nm。諸多課題組已經(jīng)研究顆粒性疫苗佐劑大小與佐劑活性之間的關(guān)系[31-32]，通常認(rèn)為，顆粒性疫苗佐劑直徑小于200 nm時(shí)可以達(dá)到最佳的免疫增強(qiáng)效力[33]。納米顆粒具有較好的佐劑活性可能與小顆粒有助于抗原提呈細(xì)胞攝取抗原、上調(diào)主要組織相容復(fù)合體以及共刺激分子的表達(dá)等原因有關(guān)[33-34]。例如，何萍等[35]通過(guò)乙型肝炎表面抗原的免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鋁佐劑納米顆粒與傳統(tǒng)鋁佐劑相比，可以誘導(dǎo)更強(qiáng)、更快的免疫應(yīng)答。

4 小結(jié)

隨著免疫學(xué)的快速發(fā)展以及研究水平和手段的深入，鋁佐劑調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用機(jī)制將更加明了。根據(jù)病原體的侵入和感染特性，我們可以通過(guò)使用佐劑，尤其是聯(lián)合佐劑來(lái)調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答的方式和水平，使之有利于傳染性疾病的防控和治療，并且同時(shí)減輕疫苗免疫的副作用。隨著鋁佐劑作用機(jī)制的研究深入，鋁佐劑在疫苗的研發(fā)和應(yīng)用上仍然會(huì)起到重要的作用。

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Update ofmechanisms ofaction for aluminum-based adjuvants

Wen Xiaobo,Zhang Lingling,Ran Xuhua
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

With the development of subunit vaccines,synthetic peptide vaccines and other noval vaccines,the varied adjuvants,including aluminum-based adjuvant,are required to modulate potent and desired immune response.However,mechanism of action for aluminum-based adjuvants, which can exclusively used in human world wide,is still not fully understood.This review mainly focuses on the relationship between characterisation of aluminum-based adjuvant and mechanism based on the recent data,in an attempt to facilitate the understanding and utilization of aluminum-based adjuvant in the generation of noval vaccines.

Adjuvant;Aluminum-based adjuvant;Mechanisms of action;Composite adjuvant; Nanoparticles

R392

A

1672-9692(2016)11-0047-06

2016-08-20

聞曉波（1977-），男，博士，副教授，研究方向：分子病毒學(xué)。

冉旭華（1978-），女，博士，副教授，研究方向：分子免疫學(xué)。

黑龍江省自然科學(xué)基金（QC2013C028，C2015042）；國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（31502098，31201909）；國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際（地區(qū)）合作與交流項(xiàng)目（31310103031）。