云南栽培瑪咖芥子油苷提取工藝的優(yōu)化*

郝利民，魯吉珂，，巴建明，崔燕，白冰，姜月蒙

1(總后軍需裝備研究所軍用漢麻材料研究中心，北京，100027)2(鄭州大學(xué)生物工程系，河南 鄭州，450001)3(解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京，100853)

瑪咖(Lepidium meyenii Walp.，Maca)，十字花科獨(dú)行菜屬1年生或2年生草本植物，瑪咖地下根是其貯藏營(yíng)養(yǎng)的主要部分［1］?，斂гa(chǎn)于南美洲秘魯海拔3 500 m的安第斯高寒山區(qū)，其栽培和食用歷史悠久，作為藥食兩用植物，傳統(tǒng)上主要用于抗疲勞、改善性功能和提高生育力等［2－3］。瑪咖已成為當(dāng)前功能食品研究的熱點(diǎn)，秘魯瑪咖的出口額由2001年的141.5萬(wàn)美元增長(zhǎng)到2010年的 617.0萬(wàn)美元［4］。2003年，我國(guó)云南成功引種瑪咖［5］，近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)瑪咖研究報(bào)道逐漸增多［6］。馮穎等對(duì)云南栽培瑪咖分析發(fā)現(xiàn)，其營(yíng)養(yǎng)成分與秘魯原產(chǎn)瑪咖相當(dāng)，具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值［7］。2011年，我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)瑪咖粉作為新資源食品。

芥子油苷(glucosinolate)也稱硫代葡萄糖苷或硫苷，是一種含氮和硫的植物次生代謝物質(zhì)，廣泛分布于十字花科植物中［8］。芥子油苷在瑪咖中含量豐富［9］，是瑪咖生理活性成分之一。2002 年 Dini等［10］首次從瑪咖根的甲醇提取液中分離得到了芐基芥子油苷(benzylglucosinolate)和間甲氧基芐基芥子油苷(m-methoxybenzylglucosinolate)，同時(shí)提出這2種芥子油苷可作為瑪咖的化學(xué)標(biāo)記。隨后，研究者又分別從瑪咖根中發(fā)現(xiàn)了一系列芥子油苷，并對(duì)其含量進(jìn)行了檢測(cè)分析［11－14］。2012 年 Gonzales［4］指出，由于芐基芥子油苷容易分解為異硫氰酸酯及其他一些小分子代謝物，其不能作為瑪咖的化學(xué)標(biāo)記。目前，關(guān)于瑪咖功效物質(zhì)的研究尚無(wú)定論，研究芥子油苷提取工藝，可為其分離純化奠定基礎(chǔ)，有助于判定瑪咖化學(xué)標(biāo)記物，這對(duì)于其生理活性研究及瑪咖功能食品開(kāi)發(fā)都具有重要意義。

本研究以云南栽培瑪咖為原料，對(duì)其干根中芥子油苷提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑪咖干根，總后勤部軍需裝備研究所瑪咖種植基地(云南麗江)，粉碎粒度150目;Sinigrin(黑芥子苷，≥99.0%)，美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司;氯化鈀、甲醇，均為分析純;羧甲基纖維素鈉，化學(xué)純。

Beckman高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司;UV－1700紫外分光光度儀，日本島津制作所;精密pH計(jì)(pHS－3C)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司;KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芥子油苷分析

芥子油苷標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確吸取0.50 mmol/L黑芥子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL 于 10 mL比色管中補(bǔ)加水到2.0 mL，再加入0.15%羧甲基纖維素鈉溶液4.0 mL，充分搖勻，加入2 mL的PdCl2顯色溶液，蓋上塞子，再充分搖勻并于25℃下放置4 h，以水-PdCl2-羧甲基纖維素鈉空白溶液為參比，540 nm下測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［15］，見(jiàn)圖1。

樣品中芥子油苷含量測(cè)定:將定容的瑪咖提取液稀釋一定的倍數(shù)，準(zhǔn)確吸取樣液1.0 mL，按照上述方法顯色，測(cè)定吸光值，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出不同浸提液中芥子油苷的含量。

圖1 芥子油苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucosinolate

芥子油苷提取率/%=［浸提液中芥子油苷質(zhì)量(g)/瑪咖原料質(zhì)量(g)］×100

1.2.2 提取溶劑選擇

稱取瑪咖粉1.00 g，置于磨口錐形瓶中，按1∶20(g∶mL)料液比加入20 mL提取溶劑(分別為水、甲醇、乙醇和正己烷)，室溫浸提24 h;水浸提液真空過(guò)濾，定容至100 mL，待測(cè);甲醇、乙醇和正己烷浸提液真空過(guò)濾，濾液減壓蒸餾濃縮，浸膏加水溶解，定容至100 mL。芥子油苷含量測(cè)定參照1.2.1。

1.2.3 瑪咖芥子油苷提取單因素優(yōu)化

稱取瑪咖粉1.00 g置于磨口錐形瓶中，加入一定體積甲醇，密封后水浴加熱浸提，間歇振蕩;浸提一定時(shí)間后浸提液真空過(guò)濾，濾液減壓蒸餾濃縮，浸膏加水溶解，定容至100 mL。芥子油苷含量測(cè)定參照1.2.1。

影響瑪咖芥子油苷提取率的主要因素為提取溫度、提取時(shí)間、料液比，因此分別以這3個(gè)因素為對(duì)象，考察其對(duì)芥子油苷提取率的影響。

1.2.4 瑪咖芥子油苷提取的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比為影響因素，各取3個(gè)水平，采用 L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以芥子油苷的提取率為指標(biāo)，確定瑪咖芥子油苷的最適提取工藝。

1.2.5 瑪咖芥子油苷超聲提取工藝優(yōu)化

稱取瑪咖粉1.00g置于磨口錐形瓶中，加入一定體積甲醇，密封后于室溫下超聲輔助提取;浸提20min后浸提液真空過(guò)濾，濾液減壓蒸餾濃縮，浸膏加水溶解，定容至100mL。芥子油苷含量測(cè)定參照1.2.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑選擇

天然產(chǎn)物中功效物質(zhì)的提取常采用水、甲醇和乙醇等溶劑，首先對(duì)不同溶劑提取云南栽培瑪咖芥子油苷的效果進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表1。不同溶劑對(duì)芥子油苷提取率影響較大，正己烷為溶劑時(shí)提取率較低，僅為0.077%;而采用甲醇溶劑時(shí)芥子油苷提取率可達(dá)到1.28%(表1)。甲醇對(duì)芥子油苷具有良好的溶解性，另外，甲醇可能對(duì)瑪咖組織中可降解芥子油苷的黑芥子酶有抑制作用，從而保護(hù)芥子油苷避免被酶解。因此，采用甲醇作為芥子油苷的提取溶劑。

表1 不同溶劑提取芥子油苷結(jié)果Table 1 Extraction of glucosinolate with different solvents

2.2 水浴浸提單因素優(yōu)化

2.2.1 提取溫度對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響

溫度是影響天然產(chǎn)物功效物質(zhì)分離提取的主要因素之一，提高溫度，分子運(yùn)動(dòng)加快，提取率升高;但高溫會(huì)導(dǎo)致生物活性物質(zhì)活性損失，同時(shí)高溫操作使能耗增加，因此存在最適提取溫度。提取溫度對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響如圖2所示。隨著溫度的升高，芥子油苷提取率逐漸增加，當(dāng)提取溫度≥50℃時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定，維持在1.20%左右。由于常壓下甲醇沸點(diǎn)為64.5℃，瑪咖芥子油苷最適提取溫度應(yīng)選擇在50℃左右。

圖2 提取溫度對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the glucosinolate yield

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響

提取時(shí)間也是影響天然產(chǎn)物功效物質(zhì)分離提取的主要因素之一。適當(dāng)增加提取時(shí)間會(huì)提高提取率，但會(huì)增加成本及能源消耗。提取時(shí)間對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響如圖3所示。隨著提取時(shí)間的增加，芥子油苷的提取率逐漸增加，但增速逐漸變緩。提取12h時(shí)芥子油苷提取率為0.986%;當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到24h后，芥子油苷提取率維持在相對(duì)恒定的水平，約為1.18%～1.22%。因此，芥子油苷適宜提取時(shí)間應(yīng)選擇在12～36 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the glucosinolate yield

2.2.3 料液比對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響

料液比對(duì)天然產(chǎn)物功效物質(zhì)分離提取的影響較大，增加提取溶劑會(huì)提高提取率，但會(huì)帶來(lái)后續(xù)溶劑回收成本過(guò)高等問(wèn)題。料液比對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響如圖4所示。隨著料液比的增加，芥子油苷提取率逐漸增加。在料液比為1∶40(g∶mL)時(shí)，芥子油苷提取率為1.56%，繼續(xù)增加料液比到1∶50，提取率增加到1.66%。綜合考慮提取率和溶劑回收問(wèn)題，芥子油苷最佳提取料液比應(yīng)控制在1∶40左右。

圖4 提取料液比對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響Fig.4 Effect of extraction solid-liquid ratio on the glucosinolate yield

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、時(shí)間和料液比為考察因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn) (表2)，對(duì)瑪咖芥子油苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 瑪咖芥子油苷提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels for L9(34)orthogonal experiment design of glucosinolate extraction from maca

表3 瑪咖芥子油苷提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment for glucosinolate extraction from maca

由表3極差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響依次為:料液比(C)＞提取時(shí)間(B)＞提取溫度(A)。最佳提取條件為A1B1C3，即溫度 40℃，料液比 1∶50(g∶mL)，提取 12 h。經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下，瑪咖中芥子油苷提取率為1.45%。艾中等［12］研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)產(chǎn)瑪咖中芥子油苷含量在0.65% ～1.83%，并且其含量在不同組織、不同產(chǎn)地間均有一定的差異。本研究最優(yōu)條件下芥子油苷提取率與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

2.4 超聲提取工藝優(yōu)化

超聲輔助提取是一種有效的天然產(chǎn)物提取工藝，具有提取率高，時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。本研究對(duì)超聲波輔助提取云南栽培瑪咖芥子油苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲條件下，室溫下芥子油苷提取率較高;提取時(shí)間對(duì)芥子油苷提取率影響不大，在10～30 min內(nèi)提取率無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)未列出)。

超聲輔助提取條件下料液比對(duì)芥子油苷提取率的影響見(jiàn)圖5。隨著料液比的增加，瑪咖芥子油苷的提取率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，提取率最高可達(dá)1.66%，高于水浴浸提最優(yōu)提取率(1.45%)。超聲輔助提取工藝可縮短浸提時(shí)間，浸提溫度降低有助于降低能耗。低溫快速提取在提高效率的同時(shí)，還可最大限度地保持功效物質(zhì)活性。

3 結(jié)論

本文對(duì)提取云南栽培瑪咖中芥子油苷的不同溶劑進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示甲醇溶劑提取率最高。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，水浴浸提時(shí)各因素影響順序依次為:料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度;最優(yōu)提取工藝條件為:溫度40 ℃，料液比1∶50(g∶mL)，提取 12 h，該條件下芥子油苷提取率為1.45%。超聲輔助提取工藝優(yōu)化結(jié)果顯示，在室溫條件下，料液比1∶50，超聲輔助提取20 min，提取率1.66%。

圖5 超聲提取料液比對(duì)瑪咖芥子油苷提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the glucosinolate yield under ultrasonic extraction

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