楊梅素提取工藝優(yōu)化

鄧丹雯，楊佩，呂建垚，張彬，黃贛輝

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌，330047)

楊梅素(3，5，7，3＇，4＇，5＇-六羥基黃酮)亦稱楊梅黃酮，是從楊梅樹皮和樹葉中提取出的多羥基黃酮類化合物［1－2］。楊梅素具有較強抗氧化活性、顯著的自由基清除能力、抗炎和抗腫瘤藥效，能夠降低血糖，預防糖尿病及糖尿病并發(fā)癥［3－5］，有很好的研究價值和經(jīng)濟價值。

鑒于目前國內(nèi)對楊梅素提取工藝的研究較少，本實驗以新鮮楊梅樹葉為原料，采用乙醇回流提取、C18固相萃取小柱純化［6］的方法，對楊梅素提取工藝進行研究。通過考察液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)對楊梅素提取得率的影響，利用響應面分析法對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化［7－8］，以確定楊梅素提取最佳工藝條件，為楊梅素的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅樹葉:荸薺種楊梅樹葉，采于江西樂平;選取新鮮楊梅樹葉，用蒸餾水洗凈，放入50℃烘箱烘干后粉碎，過40目篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

楊梅素標品:阿拉丁試劑(上海)有限公司，w＞98%;無水乙醇:分析純;甲醇、磷酸二氫鉀均為色譜純。

1.2 儀器

Aglient1260高效液相色譜儀(四元泵、紫外檢測器)，Simon Aldrich-C18固相萃取小柱，JT2003電子精密天平(河北路儀公路儀器有限分公司)，DFY－500搖擺式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE－52(上海亞榮生化儀器廠)，DHG－9053型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)，DKS－24型電熱恒溫水浴鍋(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 楊梅素的提取工藝流程

楊梅樹葉→烘干粉碎→40目篩分→回流提取→抽濾→楊梅素粗提液

1.3.2 楊梅素的提取

準確稱取適量楊梅樹葉粉末置于單口圓底燒瓶，加入一定量的乙醇水溶液，控制一定溫度回流提取一定時間后，過濾，濾液即為楊梅素粗提液。

1.3.3 單因素影響實驗

準確稱取10 g楊梅樹葉粉末，按1.3.2方法對楊梅素進行提取，主要考察液料比、提取溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間因素對楊梅素提取的影響，具體因素水平見表1。

表1 單因素實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of one-factor-at-a-time(OFAT)experiments

1.3.4 響應面法優(yōu)化提取工藝

在單因素實驗結(jié)果的基礎上，根據(jù)中心組合實驗Box-Behnken設計原理［9］，設計三因素三水平的響應面分析實驗。

1.3.5 楊梅素的測定

1.3.5.1 楊梅素的測定方法

將楊梅素粗提液旋蒸至浸膏狀，甲醇溶解定容至50 mL，吸取0.5 mL用甲醇定容至25 mL后取5 mL通過活化好的Simon Aldrich-C18固相萃取小柱，棄去最初2滴開始收集［10］，用0.22 μm針頭過濾器過濾，高效液相外標法進行分析。

1.3.5.2 HPLC檢測條件

色譜柱:Thermo-C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:0.005 mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇(體積比30∶70);流速為0.5 mL/min，進樣10 μL，柱溫25℃，檢測波長360 nm。

1.3.5.3 標準曲線繪制

準確稱取楊梅素標品10 mg置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為對照品溶液。用甲醇稀釋并定容，配成 10，20，30，40，50 μg/mL 系列濃度的楊梅素標品溶液，10 μL進樣，在1.3.5.2色譜條件下進HPLC分析，以峰面積為縱坐標(Y)，以濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線。所得回歸方程為Y=54.155X －161.47，R=0.999 6，表明樣品在 10～50 μg/mL內(nèi)線性關系良好。

1.3.5.4 得率計算

提取得率/%=(楊梅素提取量/楊梅樹葉粉末干質(zhì)量)×100

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC檢測結(jié)果

在1.3.5.2色譜條件下，標品和樣品在360 nm的波長處色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 標品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard substance

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 液料比對楊梅素提取得率的影響

固定提取溫度為90℃、乙醇體積分數(shù)為90%、提取時間為 2 h，研究液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1)對楊梅素提取得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample

圖3 液料比對楊梅素提取得率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on myricetin yield

由圖3可知，隨著液料比的增加，楊梅素提取得率提升，當液料比為10∶1時，提取得率達到最大，但隨著液料比的繼續(xù)增加，楊梅素的提取得率反而略有下降，因此確定提取楊梅素的最佳液料比為10∶1。

2.2.2 提取溫度對楊梅素提取得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)為90%、液料比為10∶1、提取時間為2h，研究提取溫度(65、75、85、95℃)對楊梅素提取得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對楊梅素提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on myricetin yield

由圖4可知，當提取溫度低于85℃時，隨著溫度的提升，楊梅素的提取得率增加;當溫度為85℃，提取得率達到最大，但當溫度繼續(xù)增加，楊梅素的提取得率反而下降，分析其原因是當提取溫度低于85℃時，溫度升高越靠近乙醇的沸點越有利于回流提取，提取得率會增加，但楊梅素在長時間高溫條件下不穩(wěn)定［11］，當溫度超過適宜溫度時，楊梅素的結(jié)構(gòu)被破壞，從而導致楊梅素的提取得率下降，因此確定提取楊梅素的最佳溫度為85℃。

2.2.3 提取時間對楊梅素提取得率的影響

固定提取溫度為85℃、液料比為10∶1、乙醇體積分數(shù)為90%，研究提取時間(1、1.5、2、2.5 h)對楊梅素提取得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取時間對楊梅素提取得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on myricetin yield

由圖5可知，當提取時間小于1.5 h時，隨著時間的延長，楊梅素的提取得率有所增加，但增加的程度變化不明顯;當提取時間超過1.5 h，隨著時間的繼續(xù)延長，楊梅素的提取得率略有下降，其原因是提取包括擴散、滲透和溶解等過程，時間延長有助于楊梅素的溶出，從而提取得率上升，但楊梅素在長時間的高溫條件下不穩(wěn)定［11］，提取時間超過1.5 h后，楊梅素的結(jié)構(gòu)可能開始被破壞，從而導致楊梅素的提取得率略有下降。綜合考慮確定提取楊梅素的最佳時間為1.5 h。

2.2.4 乙醇體積分數(shù)對楊梅素提取得率的影響

固定提取溫度為85℃、液料比為10∶1、提取時間為 1.5 h，研究乙醇體積分數(shù)(65、75、85、95%)對楊梅素提取得率的影響。結(jié)果如圖6所示。

圖6 乙醇體積分數(shù)對楊梅素提取得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on myricetin yield

由圖6可知，當乙醇體積分數(shù)低于85%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，楊梅素的提取得率增加，當乙醇體積分數(shù)為85%，提取得率達到最大，分析其原因是楊梅素微溶于水，易溶于乙醇，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，楊梅素的提取得率上升，但當乙醇體積分數(shù)達到95%時，提取溶液極性較小不利于楊梅素的提取，提取得率反而下降，因此確定提取楊梅素的最佳乙醇體積分數(shù)為85%。

2.3 響應面實驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應面實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取液料比、提取溫度、乙醇體積分數(shù)為對提取楊梅素影響顯著的3個因素，以楊梅素提取得率為響應值，因素水平編碼表見表2。

表2 響應面因素水平編碼表Table 2 Factors and levers of response surface test

響應面實驗結(jié)果如表3所示，通過Design Expert8.05數(shù)據(jù)分析軟件進行回歸分析，得到楊梅素提取得率(Y)對液料比(A)、提取溫度(B)、乙醇體積分數(shù)(C)的二次多項回歸模型為:

Y=1.29+0.24A+0.026B－0.042C－0.032AB+0.013AC+0.041BC－0.21A2－0.16B2－0.061 C2

表3 響應面實驗結(jié)果Table 3 Test design and results of response surface analysis

2.3.2 回歸方程方差分析

方差分析結(jié)果如表4所示，由表4可以看出，模型Prob＞F值小于0.01，表明該模型方程極顯著，不同處理間的差異高度顯著，說明這種實驗方法是準確可靠的，使用該方程模擬真實的三因素三水平的分析是可行的。由表4的Prob＞F值知，方程中A、A2、B2對楊梅素提取得率Y值的影響極顯著，C、C2對Y值的影響顯著，表明實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大的影響，交互項作用的影響較小。從表4還可以看出，在所選取因素水平范圍內(nèi)，對楊梅素提取得率的影響大小依次為:液料比＞乙醇體積分數(shù)＞提取溫度。且模型的復相關系數(shù)為R2=98.05%，大于90%，說明模型擬合程度良好，實驗誤差小，可以用于楊梅素提取實驗的理論預測。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

2.3.3 響應面曲面分析

根據(jù)二次多項回歸模型作出的相應的響應面圖及等高線圖見圖7～圖9。響應面的坡度變化及等高線的形狀可以反映各因素間的交互作用效應［12］。

圖7 提取溫度和液料比對楊梅素提取得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of extraction temperature and liquid-to-material ratio on myricetin yield

從圖7響應面圖可以看出，當固定乙醇體積分數(shù)為85%時，液料比A的變化引起的響應面坡度變化較陡峭，而提取溫度B的變化引起的響應面坡度變化相對平緩，說明在兩者的交互作用中液料比A相對于提取溫度B而言居于主要方面。由圖7等高線可知，橢圓在料液比A區(qū)域排列更密集，表明料液比A的變化對響應值變化的影響更大;等高線的形狀偏圓形表示2個因素交互作用不太顯著。

從圖8響應面圖可以看出，當固定提取溫度為85℃時，液料比A的變化引起的響應面坡度變化比乙醇體積分數(shù)C更陡峭，說明在兩者的交互作用中，影響楊梅素提取得率的主要方面是液料比A。由圖8等高線圖可知，橢圓在料液比A區(qū)域排列更密集，表明料液比A的變化對響應值變化的影響更大;等高線的形狀為橢圓形，表示液料比A和乙醇體積分數(shù)C交互作用很顯著。

圖8 乙醇體積分數(shù)和液料比對楊梅素提取得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of ethanol concentration and liquid-to-material ratio on myricetin yield

圖9 提取溫度和乙醇體積分數(shù)對楊梅素提取得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of extraction temperature and ethanol concentration on myricetin yield

從圖9響應面圖可以看出，當固定液料比為10∶1時，乙醇體積分數(shù)C的變化引起的響應面坡度變化比提取溫度B更陡峭，說明在兩者的交互作用中，影響楊梅素提取得率的主要方面是乙醇體積分數(shù)C。由圖9等高線圖可知，等高線的形狀為偏橢圓形，表示提取溫度B和乙醇體積分數(shù)C交互作用較顯著。

2.4 驗證實驗

根據(jù)響應面分析得出優(yōu)化條件為提取溫度84.86℃、乙醇體積分數(shù)82.09%、液料比為12.82∶1、提取時間1.5 h，回歸模型算出的理論預測值為1.36%;為證實回歸模型的可靠性，在此優(yōu)化條件下進行3次提取驗證實驗，結(jié)果如表5所示，將實驗值與預測值相比較，相對誤差僅為0.88%，由此證明該回歸模型的可靠性。

表5 驗證實驗結(jié)果Table 5 Verification results of myricetin extraction

3 結(jié)論

采用乙醇回流提取楊梅素，在提取溫度、乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間4個工藝條件中，液料比對楊梅素的提取得率影響達到極顯著水平，乙醇體積分數(shù)對楊梅素的提取得率影響顯著，而提取溫度、提取時間對楊梅素的提取得率的影響不顯著。分析結(jié)果表明，楊梅樹葉中楊梅素的最佳提取條件為提取溫度84.86℃、乙醇體積分數(shù)82.09%、液料比為12.82∶1、提取時間1.5 h。在此條件下，楊梅素的提取得率可達1.355%。

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