樹脂法分離純化荔枝核黃酮*

江敏，胡小軍，林彩霞，梁樹堯

(湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院廣東高校新材料工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東湛江，524048)

荔枝核是無患子科植物荔枝(Litchi chinensis Sonn).的成熟種子，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛功效。荔枝核的化學(xué)成分有甾類、皂苷、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、脂肪酸、聚合花色素、糖類、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽以及黃酮［1－3］。黃酮是其主要成分之一，荔枝核黃酮在Hep－2細(xì)胞中對呼吸道合胞病毒有抑制作用［4］，還具有抗氧化［5］、抗流感病毒［6］、抗乙型肝炎病毒［7］、抗 SARS 病毒［8］等多種藥理作用。目前荔枝核黃酮主要采用乙醇提?。?－10］，所得粗提物含有其他醇溶性雜質(zhì)，需要進(jìn)一步分離、純化。大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)和選擇性吸附功能的高分子材料，目前已經(jīng)廣泛用于天然活性成分如黃酮［11］、生物堿［12］、皂苷［13］等成分的分離和純化。本文就大孔吸附樹脂對荔枝核黃酮的吸附性能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

荔枝核，購于湛江正德醫(yī)藥有限公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購于中國藥品生物制品檢定所。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇等，均為國產(chǎn)分析純。

HPD600、HPD700、HPD750、HPD800 大孔樹脂，購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪儀器廠;ZS-HA水浴振蕩器，中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;MP1100電子天平，上海濟(jì)成分析儀器有限公司;DHG－9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BT－100恒流泵，上海青浦瀘西儀器廠;BSZ－100自動部分收集儀，上海青浦瀘西儀器廠;756M紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 荔枝核黃酮分析方法

采用NaNO2-Al(NO)3比色法測定［14］，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品建立回歸方程為:y=0.338 4x+0.003 3，R2=0.999 2;其中 x，吸光度，y，蘆丁含量，mg。

1.3.2 吸附樣品的制備

荔枝核粉碎、烘干，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，料液比1∶10(g∶mL)回流提取2次，離心提取液，備用。

1.3.3 大孔樹脂的預(yù)處理

先用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡樹脂24 h，抽濾、醇洗，至洗出液加水稀釋不渾濁(取1.0 mL乙醇洗出液加5 mL水不混濁)為止，然后用蒸餾水洗滌至無醇，即可使用。

1.3.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 樹脂的篩選

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后抽干的樹脂各3.0 g裝入具塞磨口三角瓶中，分別加入濃度為23 mg/mL荔枝核黃酮溶液80 mL，于水浴振蕩器中，在室溫25℃以100 r/min的頻率回旋振蕩，每隔2.5 h量取5 mL過濾，測定濾液中剩余荔枝核黃酮濃度，分別按(1)式計(jì)算各種樹脂室溫下的靜態(tài)吸附量，直到樹脂吸附飽和為止。

式中:Q，吸附量，mg/g;cx，第x次測得荔枝核黃酮溶液濃度，mg/mL;Vx，第x次的荔枝核黃酮溶液體積，mL;m，樹脂的質(zhì)量，g。

1.3.4.2 樹脂解吸量和解吸率的測定

將1.1中4種已吸附飽和的樹脂分別稱取3份0.60 g的樹脂分別用70%的乙醇與吸附相同的條件下振蕩，每隔1.5 h量取5 mL溶液過濾，測定此時(shí)濾液中荔枝核黃酮濃度，根據(jù)式(2)計(jì)算解吸量，直到解吸平衡。根據(jù)(3)式計(jì)算各樹脂的解吸率。通過吸附和解吸選擇合適的樹脂。

式中:Q，解吸量，mg/g;cx，第x次測的荔枝核黃酮溶液濃度，mg/mL;Vx，第x次的荔枝核黃酮溶液體積，mL;m，樹脂的質(zhì)量，g。

式中:D，解吸率，%;Q解吸，每克樹脂解吸平衡后得到最大荔枝核類黃酮的量，mg;Q吸附，每克樹脂吸附平衡后吸附荔枝核黃酮的最大量，mg。

1.3.4.3 吸附等溫線的繪制［15］

分別稱取抽干的樹脂2.0 g，置于200 mL具塞磨口三角瓶中，依次向三角瓶中加入不同濃度的荔枝核黃酮溶液，在25℃下于頻率100 r/min水浴振蕩器上振蕩。經(jīng)過一定時(shí)間，待吸附達(dá)到平衡后，測其荔枝核黃酮的濃度，計(jì)算其靜態(tài)吸附量;以靜態(tài)吸附量和對應(yīng)的平衡濃度作圖，即為該溫度下吸附樹脂對荔枝核黃酮的吸附等溫線。

1.3.4.4 吸附液pH值的選擇

準(zhǔn)確稱取抽干的樹脂2.0 g，置于200 mL具塞磨口三角瓶中，再依次加入不同pH值的荔枝核黃酮溶液，測定其荔枝核黃酮的靜態(tài)吸附量，研究其對荔枝核黃酮吸附性能的影響，確定適宜上柱的pH值。

1.3.5 動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

樹脂濕法裝柱，在pH5，25℃條件下，荔枝核黃酮提取液50 mL以一定的流速通過樹脂柱，測定流出液中荔枝核黃酮濃度，以流出液與上樣液的荔枝核黃酮的濃度差為縱坐標(biāo)，以上樣液濃度為橫坐標(biāo)作圖，為樹脂的動態(tài)吸附曲線。研究上柱液流速、濃度等因素對樹脂動態(tài)吸附性能的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 樹脂的篩選

2.1.1.1 不同樹脂靜態(tài)吸附性能比較

由圖1可以看出，0～12 h內(nèi)隨著吸附時(shí)間的增加4種樹脂吸附黃酮量也隨著增加，12.5 h后達(dá)到飽和，HPD800吸附速度最快，10 h已經(jīng)基本達(dá)到吸附飽和。HPD700只需要5 h達(dá)到飽和，但HPD800吸附對黃酮的吸附量最多，此條件下，最多可達(dá)470.250 7 mg/g，而HPD700吸附黃酮的量最少為186.724 4 mg/g。從中可以看出弱極性、中極性和極性樹脂的吸附能力較強(qiáng)，而非極性樹脂的吸附能力較差。其原因可能是由于荔枝核類黃酮物質(zhì)含有酚羥基，呈現(xiàn)一定的極性和弱酸性，因此選擇具有一定極性和堿性的大孔樹脂有利于荔枝核類黃酮物質(zhì)的吸附。

圖1 不同樹脂靜態(tài)吸附性能比較Fig.1 Comparison of static adsorption performance of different resins

2.1.1.2 不同樹脂靜態(tài)解吸性能比較

在吸附飽和的條件下，采用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液對4種樹脂吸附荔枝核黃酮的解吸結(jié)果見圖2和表1。

表1 不同樹脂解吸率比較Table 1 Comparison of desorption rate of different resins

從圖2可看出，0～4.5 h內(nèi)，隨著解吸時(shí)間的增加，解吸黃酮的量增加，都在4.5 h后達(dá)到最高解吸量。其中解吸HPD800樹脂的黃酮，解吸量最高達(dá)到466.726 0 mg/g，最小的為解吸HPD700樹脂的黃酮，解吸量為118.934 8 mg/g。由表1可知，HPD800樹脂的解吸率最大，達(dá)到99.25%。

在4種大孔樹脂中，HPD800大孔樹脂分離荔枝核黃酮吸附量和解吸量以及解吸率都比較高，均大于HPD600、HPD700、HPD750樹脂。因此綜合上述指標(biāo)，選用HPD800樹脂用于分離、純化荔枝核黃酮。

2.1.2 HPD800大孔樹脂吸附等溫線的繪制

圖2 不同樹脂解吸性能比較Fig.2 Comparison of desorption performance of different resins

HPD800大孔樹脂的吸附等溫線見圖3。可以看出，在25℃下HPD800樹脂對荔枝核類黃酮的吸附平衡過程。用Langmuir公式和Freundlich公式進(jìn)行擬合。根據(jù)Langmuir等溫方程:

式中:Qmax，每克濕樹脂的最大吸附量，mg/g;Q，平衡樹脂吸附量，mg/g;c，平衡濃度，mg/mL;a，常數(shù)。以c/Q對C作圖得一直線，斜率為1/Qmax，截距為1/aQmax，進(jìn)行方程回歸并計(jì)算R12值。根據(jù)Freundlich等溫方程:

式中:n，K為常數(shù)。

在雙對數(shù)坐標(biāo)下作圖，LnQ=nLnc+LnK，得線性方程，進(jìn)行回歸并計(jì)算值。結(jié)果見表2，由表2可知:Langmuir模型比Freundlich模型能夠更好的描述荔枝核黃酮在HPD800樹脂上的吸附平衡過程，其相關(guān)系數(shù)R大于0.99。

圖3 HPD800樹脂吸附等溫線Fig.3 Adsorption isotherm of HPD800 macroporous resin

2.1.3 pH值對吸附的影響

分別測定荔枝核黃酮溶液在不同pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 時(shí)的靜態(tài)吸附量，結(jié)果如圖 4 所示?？梢钥闯?，一定的酸性條件有利于荔枝核類黃酮的吸附。其原因可能是類黃酮化合物含有酚羥基，在酸性條件下以分子狀態(tài)存在，主要以范德華力與樹脂進(jìn)行物理吸附。因此確定吸附pH值5.0為宜。

表2 模擬方程參數(shù)計(jì)算結(jié)果Table 2 Calculated results of model parameters

圖4 pH值對吸附特性的影響Fig.4 Effect of pH on adsorption performance

2.2 HPD800大孔樹脂動態(tài)吸附的特性

2.2.1 流速對HPD800大孔樹脂動態(tài)吸附的影響

荔枝核黃酮濃度32.0 mg/mL，溫度25℃，pH值為5.0，控制不同吸附流速，收集流出液，測定黃酮含量，計(jì)算濃度差，繪制不同流速對濃度差的動態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖5。吸附流速對吸附效果的影響顯著，流速過快會導(dǎo)致樹脂不能充分吸附，而造成吸附效果不佳，流速過慢時(shí)可能會造成部分已吸收的類黃酮被重新洗脫下來，也會使得吸附效果下降。從圖5可以看出，3.0 mL/min為HPD800樹脂對荔枝核黃酮提取液最適宜的吸附流速。

圖5 吸附流速對樹脂吸附特性的影響Fig.5 Effect of flowing velocity on adsorption performance

2.2.2 黃酮濃度對HPD800動態(tài)吸附的影響

將50mL不同濃度，pH值為5.0的荔枝核黃酮溶液在樹脂柱高為20 cm，流速為3.0 mL/min分別進(jìn)行吸附，收集流出液，測定黃酮含量，計(jì)算濃度差，繪制不同濃度對濃度差的動態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著樣品濃度的增加，吸附量逐漸增加，但是當(dāng)濃度增加到30.8106 mg/mL后，吸附量隨著濃度的提高，反而下降，可能因?yàn)槔笾祟慄S酮濃度太高，溶解性降低不利于樹脂對其吸附。綜合考慮，適宜吸附的荔枝核類黃酮溶液濃度30.81 mg/mL。

圖6 黃酮濃度對樹脂吸附特性的影響Fig.6 Effect of flavone concentration on adsorption performance

3 結(jié)論

(1)大孔樹脂HPD800是吸附荔枝核黃酮較為理想的樹脂。靜態(tài)吸附平衡時(shí)間為10 h;吸附溶液適宜的pH值為5.0。

(2)通過吸附等溫線，Langmuir模型比Freundlich模型能夠更好的描述荔枝核黃酮在HPD800樹脂上的吸附平衡過程，所得回歸方程為:c/Q=c/434.78+1/1.35×434.78(R2=0.999 3)，其相關(guān)系數(shù)R＞0.99。

(3)樹脂柱的較佳操作條件為:流速3.0 mL/min，荔枝核黃酮濃度30.81 mg/mL。

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