瑪咖中芥子油苷及其降解過程的研究進(jìn)展

顏穗桐，魏金超，高玉梅，陳芮*

1. 云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院（昆明 650500）；2. 中國科學(xué)院化學(xué)研究所（北京 100190）

瑪咖（Lepidium meyeniiWalp.）是逐漸被人們認(rèn)識(shí)的一種食品補(bǔ)充劑。研究表明，瑪咖的主要生物活性成分為芥子油苷（glucosinolates）、瑪咖酰胺（macamide）、瑪咖烯（macaene）、生物堿（alkaloid）和甾醇（steroid）?，斂е械慕孀佑蛙占捌浣到猱a(chǎn)物——異硫氰酸酯（ITCs）因具有良好的抗腫瘤活性，進(jìn)而引起人們對瑪咖研究的極大興趣。

芥子油苷，又稱為硫代葡萄糖苷。芥子油苷是十字花科植物中廣泛存在的一種重要含硫次生代謝產(chǎn)物。從雙子葉被子植物的16個(gè)科中已鑒定出120余種不同芥子油苷。1970年，Marsh等[1]用X射線分析了芥子油苷的晶體結(jié)構(gòu)后，認(rèn)為芥子油苷都具有相同的基本結(jié)構(gòu)式，即具有側(cè)鏈（R）以及和硫連接的β-D-吡喃葡萄糖部分（見圖1）。根據(jù)其側(cè)鏈基團(tuán)R的來源，芥子油苷可分為脂肪族、芳香族和吲哚族3類。

圖1 芥子油苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2002年，Dini等[2]和Piacente等[3]先后報(bào)道了在瑪咖根中能夠檢測到芐基芥子油苷（benzyl glucosinolate或glucotropaeolin）和甲氧基芐基芥子油苷（methoxybenzyl glucosinolate或glucolimnanthin）等。Huang等[4]研究顯示，瑪咖中含有9種芥子油苷，其中包括脂肪族、芳香族、吲哚族。

瑪咖中總芥子油苷含量最高的部位是新鮮的塊根，其次是種子、植株、干燥的塊根及新鮮的葉子。Clément等[5]發(fā)現(xiàn)瑪咖的下胚軸和葉子中均含有脂肪族、芳香族和吲哚族3類芥子油苷。芳香族芥子油苷在瑪咖中含量最多，約占總芥子油苷的90%，主要為芐基芥子油苷、3-甲氧基芐基芥子油苷和對羥基芐基芥子油苷（glucosinalbin），其次為脂肪族類芥子油苷，包括5-甲基亞磺酰戊基芥子油苷（glucoalyssin）和4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷（glucoraphnin）?，斂е羞胚犷惤孀佑蛙蘸孔钌?，主要為4-羥基吲哚基-3-甲基芥子油苷（glucobrassicin）。

盡管瑪咖中均含有脂肪族、芳香族、吲哚族3類芥子油苷，但是不同顏色的瑪咖中芥子油苷含量存在很大差異。Meissner等[6]通過對中國和秘魯2個(gè)產(chǎn)地不同顏色的瑪咖中芥子油苷種類及含量進(jìn)行試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，不同顏色、不同種植地區(qū)的瑪咖中芥子油苷種類及含量有顯著差異。這可能是由于瑪咖的種類及生長環(huán)境不同導(dǎo)致，其中土壤的質(zhì)地、pH及可利用的有機(jī)成分都可能是造成差異的原因。此外，干燥方法和處理?xiàng)l件對瑪咖中芥子油苷的含量也會(huì)產(chǎn)生很大影響[7]。

1 芥子油苷的提取、純化及檢測

1.1 芥子油苷的提取及純化

1.1.1 提取

芥子油苷的提取方法主要有微波法、水浴法及溶劑熱提法[8]?，斂е薪孀佑蛙盏奶崛∫话闶褂萌軇崽岱?。提取芥子油苷時(shí)，一般選用對芥子油苷有較大溶解度的溶劑來提高提取效率。通常選擇水、乙醇、甲醇等作為提取芥子油苷的溶劑。郝利民等[9]選用水、甲醇、乙醇、正己烷4種有機(jī)溶劑分別作為提取劑對瑪咖中芥子油苷進(jìn)行提取。通過比較提取率，得出甲醇作為溶劑提取效率最高，水次之，正己烷最弱的結(jié)論。

1.1.2 純化

對粗提得到的芥子油苷通常采用陰離子交換柱等傳統(tǒng)的柱層析方法進(jìn)行純化處理。普遍選擇的層析柱填料包括酸性氧化鋁、大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂或者DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝膠等。采用這些柱層析進(jìn)行純化，效果較好，得到的芥子油苷樣品純度較高。

吳謀成等[10]曾利用酸性氧化鋁作為填料，硝酸鉀為洗脫劑，得到芥子油苷的粗結(jié)晶。周錦蘭等[11]采用酸性氧化鋁色譜柱及反相C18硅膠柱相結(jié)合的方法對芥子油苷進(jìn)行提純。這種方法具有便捷、成本較低的特點(diǎn)，適于分離提純菜籽中的芥子油苷。Wang等[12]通過對3種活性炭及5種大孔樹脂進(jìn)行吸附解吸試驗(yàn)以篩選適合提純芥子油苷的填料。結(jié)果表明，由于芥子油苷分子中的陰離子基團(tuán)—SO3-能與D261大孔陰離子樹脂表面的陽離子季胺官能團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)而能夠更好地吸附芥子油苷，因此D261大孔陰離子樹脂更適合芥子油苷的提純。在此基礎(chǔ)上，采用制備型液相色譜進(jìn)一步分離純化即可獲得純度更高的芥子油苷樣品。

1.2 芥子油苷的分離鑒別

分離鑒別芥子油苷的方法有紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）及核磁共振波譜（NMR）等。

紙色譜與薄層色譜法主要在20世紀(jì)70年代前被廣泛使用。Ettinger和Lundeen首先利用薄層色譜法從植物中分離得到烯丙基芥子油苷（Sinigrin），并給出芥子油苷的一般結(jié)構(gòu)。由于薄層色譜法分離出芥子油苷的種類有限，且分離效果不夠理想，因此這種方法現(xiàn)已不再被廣泛采用。

GC-MS和LC-MS是分離鑒別瑪咖中芥子油苷最常用的方法。Foerster等[13]報(bào)道采用氣相色譜（GC）法分離檢測芥子油苷。由于GC的檢測對象是沸點(diǎn)低于500 ℃、熱穩(wěn)定性好、相對分子質(zhì)量＜400的易揮發(fā)性物質(zhì)，而芥子油苷在瑪咖中主要是以鹽的形式存在，熔、沸點(diǎn)較高，因而不能直接利用GC進(jìn)行測定。進(jìn)行GC測定前，需要將芥子油苷酶解轉(zhuǎn)化為異硫氰酸鹽等易揮發(fā)的物質(zhì)。采用GC-MS定性是通過比較ITCs標(biāo)準(zhǔn)品與芥子油苷酶解得到的ITCs的保留時(shí)間，并結(jié)合MS給出的分子量及碎片離子信息等對芥子油苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷。由于吲哚類芥子油苷對溫度極其敏感，如在較低溫度下，這類芥子油苷的衍生化反應(yīng)不完全，溫度升高時(shí)，又易分解，因此采用GC-MS分析吲哚類芥子油苷的結(jié)果不理想[14]。

與GC不同，采用高效液相色譜（HPLC）法分析樣品時(shí)，不受試樣的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性的限制，因此HPLC應(yīng)用范圍廣。HPLC-MS具有兩種分析方法的特點(diǎn)，不僅可以對目標(biāo)化合物的相對分子質(zhì)量、離子碎片及物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，同時(shí)還具有高效、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，已成為天然產(chǎn)物分離、分析、結(jié)構(gòu)鑒定的強(qiáng)有力工具。芥子油苷極性大，直接采用反相C18柱進(jìn)行分離時(shí)保留能力差，不利于有效的分離。因此在使用HPLC對芥子油苷進(jìn)行分析時(shí)，需要采用硫酸酯酶對芥子油苷進(jìn)行脫硫處理得到脫硫芥子油苷（desulphation）。經(jīng)脫硫處理后，與氮原子相連的硫酸根被氫氧根所取代，產(chǎn)物的極性顯著降低[15]，這時(shí)候進(jìn)行分析能得到較好的分離效果。Zhang等[16]通過對芥子油苷進(jìn)行脫硫處理，得到脫硫芥子油苷。采用HPLC結(jié)合高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜儀（HPLC-ESIMS）根據(jù)帶負(fù)電荷的分子離子峰、色譜圖上的保留時(shí)間及質(zhì)譜給出的碎片離子信息對脫硫芥子油苷進(jìn)行分析，鑒別出所對應(yīng)的芥子油苷種類。

1.3 芥子油苷的含量測定

測定芥子油苷含量的方法可為間接測量法和直接測量法。

間接測量法是將芥子油苷酶解，對酶解后的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，如通過測定ITCs、硫氰酸酯等的含量，可間接測定芥子油苷的含量。由于影響酶解過程的因素較多，導(dǎo)致測量結(jié)果波動(dòng)較大，準(zhǔn)確度不高。GC對芥子油苷的定量分析方法就是通過內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法，以ITCs為標(biāo)準(zhǔn)品，通過計(jì)算芥子油苷水解得到的ITCs含量間接求出芥子油苷含量。

直接測量法是通過直接測定總芥子油苷的含量或者采用分量法對樣品中芥子油苷的每一種組分進(jìn)行分析。該法主要用于分析每種樣品中芥子油苷組成的差異[17]。顧振新等[18]提供了一種測定植物中芥子油苷總含量的方法，即：將經(jīng)粉碎的植物原料用乙酸鹽緩沖液勻漿；勻漿液經(jīng)高溫水浴滅酶后，依次添加聚乙烯吡咯烷酮、醋酸鉛混合液及飽和硫酸鈉溶液；振蕩混勻后離心制得芥子油苷提取液；芥子油苷提取液分別采用堿降解、37%濃鹽酸中和；中和液再與鐵氰化鉀溶液反應(yīng)后，用紫外-可見分光光度計(jì)在420 nm處測定鐵氰化鉀吸光度的減少量，以烯丙基芥子油苷為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得到植物中總芥子油苷含量。

總芥子油苷含量還可利用芥子油苷與氯化鈀反應(yīng)生成有色芥子油苷鈀的原理通過分光光度法在540 nm下進(jìn)行比色定量[19]。該方法的缺點(diǎn)是顯色時(shí)間長，在復(fù)雜的體系下受溫度和樣品芥子油苷濃度影響較大，進(jìn)而產(chǎn)生較大誤差。

HPLC可通過峰面積和樣品量的線性關(guān)系來對芥子油苷進(jìn)行定量。該方法重現(xiàn)性好、精密度高，并且能同時(shí)檢測總芥子油苷及單個(gè)芥子油苷含量。缺點(diǎn)是前期硫酸酯酶處理過程復(fù)雜、耗時(shí)、設(shè)備價(jià)格昂貴等。

2 芥子油苷降解過程與產(chǎn)物

用于降解芥子油苷的植物糖基化酶是黑芥子酶（myrosinase）。黑芥子酶又稱為β-硫代葡萄糖苷酶，在植物體內(nèi)一般以二聚體的形式存在。黑芥子酶是較為穩(wěn)定的一類酶，能在pH 5～8的環(huán)境下保持活性[20]。在植物中黑芥子酶不是單獨(dú)存在的，它通常與芥子油苷共同構(gòu)成特殊的底物酶系統(tǒng)[21]。

2.1 芥子油苷的降解過程

2.1.1 芥子油苷的酶降解

黑芥子酶和芥子油苷位于幼苗植物細(xì)胞的不同區(qū)域。黑芥子酶定位于細(xì)胞的特定蛋白體中，而芥子油苷分布于細(xì)胞液中。植物組織受到損傷時(shí)，黑芥子酶細(xì)胞中的黑芥子酶將被釋放，并與芥子油苷結(jié)合[22]。芥子油苷降解后產(chǎn)生1分子葡萄糖和糖苷配基，糖苷配基不穩(wěn)定，隨即重組形成生物活性化合物，如腈、硫氰酸鹽和異硫氰酸鹽、惡唑烷-2-硫酮等物質(zhì)[23]，芥子油苷酶降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖2所示。芥子油苷則被認(rèn)為是異硫氰酸鹽穩(wěn)定的水溶性前體。

圖2 芥子油苷酶解過程的產(chǎn)物

2.1.2 影響酶降解的因素

芥子油苷降解得到的產(chǎn)物有些是對人體有害的，如腈類物質(zhì)；另一些物質(zhì)則是對人體有益的，如具有抗癌作用的硫氰酸酯類物質(zhì)。體系pH、側(cè)鏈基團(tuán)R及植物種類等因素會(huì)對酶降解產(chǎn)物產(chǎn)生影響。

一般情況下，在pH 5～8的中性體系中，芥子油苷經(jīng)過酶水解生成糖苷配基和D-葡萄糖2種初產(chǎn)物，不穩(wěn)定的糖苷配基發(fā)生Lossen重排，形成異硫氰酸鹽；在pH 2～5的酸性體系中，中間產(chǎn)物易發(fā)生脫硫反應(yīng)，芥子油苷主要轉(zhuǎn)化為腈類化合物；在堿性條件下，黑芥子酶易失活，中間產(chǎn)物將生成硫代氰酸鹽[24]。

除此之外，結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈基團(tuán)R會(huì)對降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響?；鶊F(tuán)R若為甲基、烯丙基、3-丁烯基、芐基或間甲氧基芐基時(shí)，其酶解易于產(chǎn)生具有相應(yīng)揮發(fā)性的ITCs。對于大部分芥子油苷而言，酶解都能形成較為穩(wěn)定的ITCs。而側(cè)鏈中含有β-羥基時(shí)，酶解會(huì)形成不穩(wěn)定的ITCs，后環(huán)化形成硫代惡唑烷酮。

2.1.3 芥子油苷的無酶降解

芥子油苷既能夠在黑芥子酶參與下進(jìn)行降解，也能在高溫高壓、無黑芥子酶參與的情況下發(fā)生降解。一般情況下，無酶降解的產(chǎn)物為腈類物質(zhì)及ITCs[25]。降解的產(chǎn)物及反應(yīng)速度受反應(yīng)體系中溫度、壓強(qiáng)、含水量、反應(yīng)化學(xué)試劑以及是否有過渡金屬離子參與等因素的影響。如高溫條件下，無酶降解的產(chǎn)物以腈類物質(zhì)為主；體系含水量降低時(shí)，降解速度會(huì)變慢。

3 芥子油苷及其降解產(chǎn)物的生理活性

瑪咖獨(dú)特、刺鼻的味道主要來源于芥子油苷降解得到的ITCs[26]?，斂е薪孀佑蛙盏慕到猱a(chǎn)物具有生理活性如下：

3.1 殺蟲、除菌

芥子油苷酶系統(tǒng)是植物的一種化學(xué)防御系統(tǒng)。芥子油苷被黑芥子酶降解后，得到的最常見的一類水解產(chǎn)物是ITCs。ITCs在十字花科植物化學(xué)預(yù)防機(jī)制中起主要作用。ITCs對于不以十字花科為食的昆蟲有劇毒。因此芥子油苷可以抑制真菌、微生物的生長，可作為天然殺蟲劑被使用[27]。

3.2 抗腫瘤

芥子油苷及其分解產(chǎn)物因?yàn)榫哂锌拱┗钚远饘W(xué)者們的廣泛關(guān)注。芥子油苷在黑芥子酶的蛋白催化下產(chǎn)生最具有活性的水解產(chǎn)物ITCs。在抑制腫瘤過程中，ITCs通過誘導(dǎo)泛醌還原酶的活性成為致癌物的阻斷劑，而對正常細(xì)胞和淋巴系統(tǒng)均無害。

瑪咖之所以表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制癌癥的功能，是由于其含有芥子油苷，尤其是瑪咖中含量最高的芐基芥子油苷和甲氧基芐基芥子油苷水解得到的芳香族ITCs所起的作用[28]。

4 結(jié)語與展望

芥子油苷是瑪咖中一種重要的次生代謝物。芥子油苷及其降解產(chǎn)物ITCs對瑪咖的抗腫瘤活性起著重要作用。隨著科技的發(fā)展以及分析檢測技術(shù)的提高，人們對芥子油苷的研究逐漸深入，特別是對芥子油苷的提取、純化、鑒別、定量及其降解過程均有深入研究。

由于影響芥子油苷種類及含量的因素很多，且芥子油苷的降解過程很復(fù)雜，因此在對芥子油苷的研究過程中，仍存在很多急需解決的問題。鑒于芥子油苷及其降解產(chǎn)物具有殺蟲、除菌、抗腫瘤等優(yōu)異的生理活性，如何提高芥子油苷的提取效率仍是研究熱點(diǎn)之一。芥子油苷降解過程中會(huì)產(chǎn)生對人體有害的腈類物質(zhì)，研究芥子油苷降解過程及影響因素，通過改變控制條件降低芥子油苷降解過程中產(chǎn)生的腈類物質(zhì)也是芥子油苷研究的重點(diǎn)。此外，提高瑪咖中芥子油苷的利用效率等均是具有重要價(jià)值的芥子油苷研究方向。