濁度法測(cè)定紅霉素效價(jià)

楊玉玲，吳愫青

（珠海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 519000）

國(guó)際上抗生素效價(jià)測(cè)定以管碟法和濁度法并行，濁度法具有耗時(shí)短、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、人為影響因素少、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度與精密度高的優(yōu)點(diǎn)，《中國(guó)藥典》自2005年版已收載濁度法。本文對(duì)紅霉素效價(jià)測(cè)定的濁度法和管蝶法進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)，進(jìn)一步比較管碟法、濁度法測(cè)定過(guò)程中的優(yōu)缺點(diǎn)和影響因素。

1 材料與儀器

1.1 材料 金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)130307-201417，效價(jià)928 U/mg，由中國(guó)食品藥品檢定院提供）；紅霉素腸溶片（批號(hào)11200203、11190308，來(lái)源于特一藥業(yè)集團(tuán)有限公司；批號(hào)190701，來(lái)源于廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；紅霉素腸溶膠囊（批號(hào)190104，來(lái)源于浙江華潤(rùn)三九眾益制藥有限公司）；依托紅霉素片（批號(hào)11190604、11181203，來(lái)源于特一藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；琥乙紅霉素片（批號(hào)2102035020，來(lái)源于西安利君制藥有限責(zé)任公司；批號(hào)A2105003，來(lái)源于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)A21100903，來(lái)源于浙江京新藥業(yè)股份有限公司）；依托紅霉素顆粒（批號(hào)211101，來(lái)源于湖北東信藥業(yè)有限公司）；抗生素檢定培養(yǎng)基3號(hào)（批號(hào)1100031，由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供）；氯化鈉（批號(hào)20161012，來(lái)源于天津市百世化工有限公司）；磷酸二氫鉀（批號(hào)20180226，來(lái)源于天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸氫二鉀（批號(hào)20151001-11，來(lái)源于廣州化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）；ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）；Sartorius CPA225D十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Zealway GR110DR高壓滅菌鍋（致微儀器有限公司）；DHG-9123A恒溫干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；量瓶、培養(yǎng)皿、移液管、刻度吸管。

2 方法

2.1 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備 取金黃色葡萄球菌凍干菌1支，于生物安全柜內(nèi)操作，用滅菌的0.9%氯化鈉溶液適量將凍干菌溶解并轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，于36℃培養(yǎng)26 h。再取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，于36℃培養(yǎng)20 h。待臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，作為實(shí)驗(yàn)用菌懸液。

2.2 供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品和供試品（按照管碟法制備方法進(jìn)行制備）適量，加滅菌水制成1 000 U/ml的溶液，再吸取5.0 ml 1 000 U/ml的溶液到100 ml量瓶中，定容至刻度得50 U/ml的溶液，備用。后續(xù)稀釋用pH7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋到適宜的濃度?？蛇x擇劑間比為2∶1或4∶1，抗生素最終濃度范圍為0.1～0.85 U/ml，具體濃度可以根據(jù)培養(yǎng)結(jié)束后吸光度讀數(shù)在線性范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。如選擇高低濃度為0.5和0.25 U/ml的制備過(guò)程如下：精密量取50 U/ml的溶液10.0 ml置于100 ml量瓶中，定容至刻度得5 U/ml的溶液，分別精密量取5 U/ml的溶液5.0 ml置于50 ml和100 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，配制成濃度為高濃度為0.5 U/ml、低濃度為0.25 U/ml的溶液。

2.3 供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分裝 取經(jīng)過(guò)高溫滅菌的石英比色皿16支，分別標(biāo)記為1S1～1S4共4支，2S1～2S4共4支，1T1～1T4共4支，2T1～2T4共4支，然后按照拉丁方的排列順序分別排列好。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度溶液、低濃度溶液及供試品溶液的高濃度溶液、低濃度溶液各1.00 ml按標(biāo)記的對(duì)應(yīng)編號(hào)加入相應(yīng)的比色皿中。加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液時(shí)，均在有標(biāo)記處沿管壁緩緩加入。

2.4 含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備 臨用前，取規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（35～37℃培養(yǎng)2～4 h后測(cè)定的吸光度在0.3～0.7之間，且劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1），加入到各規(guī)定的液體培養(yǎng)基中，混合，使在試驗(yàn)條件下能得到滿意的劑量-反應(yīng)關(guān)系和適宜的測(cè)定濁度。

2.5 培養(yǎng)基的分裝 取含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基，分裝至比色皿中，每管精密加入9 ml。加入培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)在加入樣品溶液的標(biāo)記處稍上方，然后沿著管壁緩緩流入，以便將沾在管壁上的供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液一起沖入比色皿底部，待溶液和培養(yǎng)基全部加完后，蓋上塞子，水平輕輕搖勻，使供試品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和培養(yǎng)基混合均勻。

2.6 培養(yǎng) 使用WBS-100微生物比濁儀在37℃培養(yǎng)2～4 h。

2.7 測(cè)量與計(jì)算 使用WBS-100微生物比濁儀可進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)并進(jìn)行在線快速測(cè)量，測(cè)量后能進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算并生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

3 結(jié)果

3.1 線性及其范圍試驗(yàn) 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（928 U/mg）適量，加滅菌水制成1 000 U/ml的溶液，用pH7.8的磷 酸 鹽 緩 沖 液 分 別 稀 釋 到0.10、0.15、0.20、0.265、0.37、0.51、0.72和1.00 U/ml的溶液，按濁度法操作。以濃度（C）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果得到：Y=0.498 9X+0.043 6（r=0.997 5），說(shuō)明在0.1～1 U/ml的濃度范圍內(nèi)，抗生素濃度的對(duì)數(shù)與吸光度呈直線關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn) 取1 000 U/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成濃度為0.25和0.5 U/ml的溶液，按照濁度法進(jìn)行精密度試驗(yàn)，共測(cè)定9次，濁度法的精密度可以達(dá)到方法學(xué)驗(yàn)證的要求，RSD為0.6%。

3.3 回收率試驗(yàn) 選擇90%、100%和110%三點(diǎn)進(jìn)行回收率試驗(yàn)。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，加pH7.8的磷酸鹽緩沖液制成1 000 U/ml的溶液。分別精密量取該溶液4.5、5.0和5.5 ml至100 ml的量瓶中，用pH7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，得到45、50和55 U/ml的溶液，分別精密量取10.0 ml置于100 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，配制成濃度為4.5、5.0和5.5 U/ml的溶液。精密量取4.5 U/ml的溶液5.0 ml分別置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，制備成濃度為0.225和0.45 U/ml的溶液，作為試驗(yàn)用90%標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密量取5.0 U/ml的溶液5.0 ml分別置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，制備成濃度為0.25和0.5 U/ml的溶液，作為試驗(yàn)用100%標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密量取5.5 U/ml的溶液5.0 ml分別置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，制備成濃度為0.275和0.55 U/ml的溶液，作為試驗(yàn)用110%標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照濁度法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果平均回收率為99.63%，RSD為0.3%。見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.4 多個(gè)廠家、多個(gè)紅霉素品種濁度法與管碟法測(cè)定結(jié)果的比較 本文選取了多個(gè)廠家的紅霉素相關(guān)品種：紅霉素腸溶片、依托紅霉素片、紅霉素腸溶膠囊、依托紅霉素顆粒、琥乙紅霉素片，分別采用兩種方法進(jìn)行測(cè)定。琥乙紅霉素相關(guān)樣品通過(guò)室溫放置16 h或40℃放置6 h達(dá)到水解完全，依托紅霉素相關(guān)樣品通過(guò)60℃水浴中放置4 h達(dá)到水解完全，最后都是采用和紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較得出結(jié)果。水解時(shí)間是影響含量測(cè)定效價(jià)值的關(guān)鍵因素，水解時(shí)間短，樣品水解不充分會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果偏低；水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)使水解得到的紅霉素再發(fā)生降解，導(dǎo)致效價(jià)測(cè)定值發(fā)生偏差。結(jié)果表明，濁度法測(cè)定結(jié)果精密度高。見(jiàn)表2。

表2 多個(gè)廠家紅霉素相關(guān)品種濁度法、管碟法測(cè)定結(jié)果比較

4 討論

管碟法和濁度法都是在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計(jì)，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價(jià)）的方法。管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大??；濁度法是利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度［1］。

抗生素微生物檢定法自40年代建立以來(lái)仍作為經(jīng)典方法之一收載于各國(guó)藥典，目前，管碟法、濁度法被作為抗生素微生物檢定方法，收載于《中國(guó)藥典》中。管碟法的缺點(diǎn)是專屬性差，凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會(huì)干擾檢驗(yàn)結(jié)果，并且操作步驟多、復(fù)雜，影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度的因素較多，需要從各個(gè)環(huán)節(jié)加以嚴(yán)格控制，減少結(jié)果誤差。

濁度法測(cè)定抗生素效價(jià)時(shí)抗生素溶液的濃度非常低，微生物污染對(duì)濁度法測(cè)定效價(jià)有很大影響，因此試驗(yàn)器具采用單獨(dú)浸泡、單獨(dú)清洗的方式，可以減少試驗(yàn)過(guò)程的交叉污染。濁度法對(duì)試驗(yàn)用培養(yǎng)基的靈敏度的要求比較高，使用的培養(yǎng)基應(yīng)澄明，顏色以盡量淺為佳，培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后、培養(yǎng)后本身不得出現(xiàn)沉淀。根據(jù)這一原則，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的預(yù)試，挑選合適品牌的產(chǎn)品使用［2］。紅霉素濁度法測(cè)定用試驗(yàn)菌為金黃色葡萄球菌，為保證試驗(yàn)的成功率，此菌懸液建議臨用現(xiàn)制。經(jīng)本試驗(yàn)驗(yàn)證，與微生物管碟法比較，濁度法具有快速（僅需3～4 h）、易于操作、可在線測(cè)定、采用液體培養(yǎng)法、無(wú)擴(kuò)散因素影響、靈敏度高和精密度較好等優(yōu)點(diǎn)，適用于紅霉素及其相關(guān)品種的含量測(cè)定。

但是，抗生素效價(jià)測(cè)定對(duì)人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)水平有較高的要求，檢驗(yàn)人員上崗前應(yīng)接受相應(yīng)的培訓(xùn)，包括實(shí)驗(yàn)室生物安全方面、微生物檢驗(yàn)技術(shù)及效價(jià)測(cè)定相關(guān)檢測(cè)方法、程序、檢測(cè)目的、檢驗(yàn)中的影響因素等的培訓(xùn)，上崗后通過(guò)不斷提高檢驗(yàn)技能，掌握檢驗(yàn)技巧，才能確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

總之，伴隨著高效液相色譜法等化學(xué)分析方法的發(fā)展和進(jìn)一步應(yīng)用，越來(lái)越多的抗生素微生物檢定分析方法逐步被化學(xué)分析方法所取代，但是，對(duì)于多組分抗生素，抗生素微生物檢定法仍然具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。而且隨著抗生素的廣泛應(yīng)用、新的抗菌藥物的研發(fā)和近年來(lái)抗生素耐藥性的產(chǎn)生，對(duì)于抗生素耐藥菌株的分析和研究，抗生素微生物檢定法也有著廣闊的發(fā)展前景。