離子色譜法測定鹿瓜多肽注射劑中鉀離子和草酸根離子的含量

馬 冰，蘇 喆，韓曉捷

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

鉀離子是人體內(nèi)的重要陽離子，血清中的鉀離子對維持體液酸堿平衡和滲透壓穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，而細(xì)胞中的鉀離子是穩(wěn)定神經(jīng)、肌肉及細(xì)胞生物電活動的主要離子［1-4］。若細(xì)胞內(nèi)鉀離子減少則內(nèi)液滲透壓降低，并出現(xiàn)心肌自動節(jié)律異常；若鉀離子增加，則會出現(xiàn)心肌過度舒張，還會引起嚴(yán)重的心臟傳導(dǎo)、收縮異常，甚至導(dǎo)致死亡。泌尿系結(jié)石是生活中常見且多發(fā)性的疾病，發(fā)病率高達(dá)10%~15%，我國泌尿系結(jié)石的成分90%以上的是草酸鈣結(jié)石［5-9］。而引起此結(jié)石的元兇就是在人體內(nèi)無法降解的草酸鹽，當(dāng)人體處理草酸鹽的能力受損時，多余的草酸鹽與鈣形成草酸鈣晶體沉積在關(guān)節(jié)處，造成身體的機(jī)械磨損；其還可與鎂、鋅、鐵等金屬離子結(jié)合形成沉淀，引起人體內(nèi)的必需礦物質(zhì)缺乏。

鹿瓜多肽注射劑中含有中藥成分甜瓜子，根據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則2400注射劑有關(guān)物質(zhì)檢查法［10］中規(guī)定：“注射劑有關(guān)物質(zhì)系指中藥材經(jīng)提取、純化制成注射劑后，殘留在注射劑中可能含有并需要控制的物質(zhì)。除另有規(guī)定外，一般應(yīng)檢查蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂等，靜脈注射液還應(yīng)檢查草酸鹽、鉀離子等?！钡凇吨袊幍洹分袡z查草酸鹽采用的是與氯化鈣生成沉淀法，檢查鉀離子采用的是與堿性甲醛反應(yīng)生成渾濁的濁度法，這些方法都具有靈敏度低、專屬性差、易受注射劑中輔料成分干擾而造成假陰性結(jié)果等特點。離子色譜法具有靈敏度高及專屬性強(qiáng)等多重特點，因此，本文分別建立了離子色譜法分別測定鹿瓜多肽注射劑中鉀離子和草酸根離子，并用該方法測定了不同企業(yè)樣品中的鉀離子和草酸根離子含量，為進(jìn)一步提高含中藥成分的多組分生化藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

鉀離子：Thermo DIONEX ICS-5000+離子色譜儀，配有CERS-500（4 mm）陽離子抑制器，Chromeleon色譜工作站；草酸根離子：Thermo DIONEX ICS-5000+離子色譜儀，配有AERS 500（4 mm）陰離子抑制器，Chromeleon色譜工作站；XS205電子天平（METTLER TOLEDO）。鉀離子標(biāo)準(zhǔn)溶液［四川中測標(biāo)物科技有限公司國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號GBW（E）082043，質(zhì)量濃度1 000μg/ml］；草酸鈉基準(zhǔn)物［四川中測標(biāo)物科技有限公司國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號GBW（E）060312，純度為99.98%］；鹿瓜多肽注射液（A企業(yè)5批次，批號181113、181206、181202、180628、181010），注射用鹿瓜多肽（B企業(yè)5批次，批號120180321、220180309、220190104、220180118、120180606；C企業(yè)5批次，批號1801301、1812306、1804302、1902302、1803303）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 鉀離子色譜條件：色譜柱為Dionex IonPac CS12A（250 mm×4 mm，8μm）；保護(hù)柱為Dionex IonPacTM CG12A（50 mm×4 mm，8μm）；淋洗液為20 mmol/L MSA溶液；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣25μl。草酸根離子色譜條件：色譜柱為Dionex IonPac AS11-HC（250 mm×4 mm，9μm）；保護(hù)柱為Dionex IonPac AG11-HC（50 mm×4 mm，9μm）；淋洗液為30 mmol/L KOH溶液；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣25μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

2.2.1.1 鉀離子對照品溶液的制備 精密量取鉀離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000μg/ml）1 ml，置25 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為鉀離子對照品溶液（40μg/ml）。

2.2.1.2 草酸根離子對照品溶液的制備 精密稱取草酸鈉基準(zhǔn)物152.57 mg，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為草酸根離子對照品貯備液（約1 000μg/ml）；精密量取上述溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液1 ml，置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為草酸根離子對照品溶液（約1μg/ml）。

2.2.2 供試品溶液的制備 取鹿瓜多肽注射液（A企業(yè)，2 mg/ml以多肽計），精密量取樣品溶液1 ml，置5 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；取注射用鹿瓜多肽（B、C企業(yè)），用水溶解并稀釋制成2 mg/ml的溶液（以多肽計），精密量取此溶液1 ml，置5 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 空白溶劑的制備 取超純水作為空白溶劑。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 鉀離子測定：取鉀離子對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑各25μl進(jìn)樣分析，空白溶劑在鉀離子對照品出峰處無干擾，見圖1（C）；鉀離子理論塔板數(shù)為7 107，見圖1（A）。草酸根離子測定：取草酸根離子對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑各25μl進(jìn)樣分析，空白溶劑在草酸根離子對照品出峰處無干擾，見圖2（C）；草酸根離子理論塔板數(shù)為6 630，見圖2（A）。以A企業(yè)批號為181113的鹿瓜多肽注射液所制備的供試品溶液為例，鉀離子與相鄰峰的分離度為3.8，見圖1（B），以B企業(yè)批號為220180309的注射用鹿瓜多肽所制備的供試品溶液為例，草酸根離子與相鄰峰的分離度為2.9，見圖2（B），均大于1.5，符合要求。

圖1 對照品（A）供試品（B）空白溶劑（C）離子色譜圖

圖2 對照品（A）供試品（B）空白溶劑（C）離子色譜圖

2.4 線性關(guān)系試驗

2.4.1 鉀離子 精密量取鉀離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000μg/ml）適量，加水稀釋制成每1 ml中約含鉀離子0.004、8、16、32、40、60和80μg的系列溶液，分別精密取上述溶液各25μl進(jìn)樣分析。以鉀離子濃度為橫坐標(biāo)（C），以峰面積為縱坐標(biāo)（A），進(jìn)行線性回歸計算。結(jié)果鉀離子在0.004～80μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為A=6.456 1C－0.099 7（r=0.999 9，n=7）。

2.4.2 草酸根離子 精密量取草酸根離子對照品貯備液（約1 000μg/ml）適量，加水稀釋制成每1 ml中約含草酸根離子0.024 1、0.401、0.802、1.604、2.004和2.606μg的系列溶液，分別精密取上述溶液各25μl進(jìn)樣分析。以草酸根離子濃度為橫坐標(biāo)（C），以峰面積為縱坐標(biāo)（A），進(jìn)行線性回歸計算。結(jié)果草酸根離子在0.024 1～2.606μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為A=0.290 5C－0.002 9（r=0.999 9，n=6）。

2.5 精密度試驗 鉀離子：取鉀離子對照品溶液（40μg/ml），連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.14%，保留時間RSD為0.06%。草酸根離子：取草酸根離子對照品溶液（約1μg/ml），連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.62%，保留時間RSD為0.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取B企業(yè)批號為220180309的注射用鹿瓜多肽，加水溶解并制成含2 mg/ml的樣品溶液（以多肽計），平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果供試品溶液（2 mg/ml以多肽計）平均鉀離子含量為0.26 mg/ml，RSD為0.20%；平均草酸根離子含量為0.012 mg/ml，RSD為0.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

2.7.1 鉀離子 取B企業(yè)批號為220180309的注射用鹿瓜多肽，加水溶解并制成含2 mg/ml的樣品溶液（以多肽計）作為樣品回收溶液。分別精密量取此溶液1 ml置10 ml量瓶中，制備9份待用；分別精密量取鉀離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000μg/ml）0.176、0.220和0.264 ml置上述10 ml量瓶中，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3份，將此9個量瓶加水稀釋至度，搖勻，作為加樣回收率試驗溶液。取上述溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果鉀離子平均回收率為100.57%，RSD為1.70%。見表1。

表1 鉀離子加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.7.2 草酸根離子 分別精密量取“2.7.1”項下樣品回收溶液1 ml置10 ml量瓶中，制備9份待用；精密量取草酸根離子對照品貯備液（約1 000μg/ml）1 ml置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別量取此溶液0.096、0.120和0.144 ml置上述10 ml量瓶中，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3份，加水稀釋至刻度，搖勻，作為加樣回收率試驗溶液。取上述溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果草酸根離子平均回收率為96.38%，RSD為0.22%。見表2。

表2 草酸根離子加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.8 定量限與檢測限

2.8.1 鉀離子 取鉀離子質(zhì)量濃度為4 ng/ml的對照品溶液進(jìn)樣分析，信噪比約為10，鉀離子定量限為0.10 ng；取鉀離子質(zhì)量濃度約為1 ng/ml的對照品溶液進(jìn)樣分析，信噪比約為3，檢測限為0.03 ng。

2.8.2 草酸根離子 取草酸根離子質(zhì)量濃度約為24.1 ng/ml的對照品溶液進(jìn)樣分析，信噪比約為10，草酸根離子定量限為0.60 ng；取草酸根離子質(zhì)量濃度約為7.2 ng/ml的對照品溶液進(jìn)樣分析，信噪比約為3，檢測限為0.18 ng。

2.9 樣品測定 照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別選取了3個廠家共15批樣品進(jìn)行鉀離子和草酸根離子的含量測定，樣品溶液均以2 mg/ml多肽計，鉀離子含量和草酸根離子含量結(jié)果見表3。

表3 樣品溶液鉀離子和草酸根含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品測定情況 為了便于在不同企業(yè)間橫向比較，樣品均制備成企業(yè)A樣品標(biāo)示的多肽濃度水平，即2 mg/ml（以多肽計）。企業(yè)B和C不同規(guī)格的凍干粉加水溶解并制成2 mg/ml（以多肽計）的樣品溶液。由表3顯示，3個企業(yè)樣品溶液中鉀離子含量介于0.10～0.34 mg/ml之間，整體趨勢為企業(yè)B>企業(yè)A>企業(yè)C；草酸根離子含量介于0.002～0.012 mg/ml之間，企業(yè)B含量明顯高于企業(yè)A和C，結(jié)果約為其他兩家企業(yè)的2倍。3個企業(yè)數(shù)據(jù)離散程度較小，表明樣品均一性良好。

3.2 限度討論 根據(jù)《中國藥典》有關(guān)規(guī)定計算得出靜脈注射的含中藥成分注射劑鉀離子限度為不得過1 mg/ml，草酸根離子限度為不得過24 mg/ml，將樣品按含鹿瓜多肽2 mg/ml的濃度計，檢測的3個企業(yè)樣品的鉀離子和草酸根離子含量均符合規(guī)定。在臨床上補(bǔ)鉀一般依據(jù)血鉀的情況使用口服制劑或者靜脈滴注的方式。鉀離子經(jīng)靜脈注射量過高則會引起嚴(yán)重后果，因此我們應(yīng)更多關(guān)注病人每日由靜脈所攝入的總鉀量，如果病人已經(jīng)在補(bǔ)鉀，更要關(guān)注中藥注射劑所帶來的“隱性鉀源”。而草酸鹽亦是如此，我們每天攝取草酸的途徑主要來源于食物，有些食物本身含草酸量很高，因此更需注意人體每日從不同渠道攝取的草酸鹽總量。