氣相色譜法測定乙基纖維素中乙醛的含量及其不確定度評定

屠哲瑋，唐倩倩，金偉斌，顧曉風(fēng)*

1 蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104；2 山東綠葉制藥有限公司，煙臺 264670

測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，也是顯示測量結(jié)果質(zhì)量的重要指標(biāo)，用于評價結(jié)果的可信賴程度。當(dāng)測量結(jié)果出現(xiàn)臨界值或?qū)⒌姆菢?biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行驗證時，不確定度評定即具有重要意義[1]?！吨袊幤窓z驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》（2019版）[2]介紹了通過pH測定法、非水溶液滴定法等檢驗方法測量不確定度評定的實例。同時，相關(guān)文獻(xiàn)報道表明[3-5]，測量不確定度評定廣泛應(yīng)用于藥物制劑、原料藥等領(lǐng)域 。

乙基纖維素（ethyl cellulose）是一種纖維素的醚化衍生物，因其良好的成膜性和水不溶性，是制備藥物緩控釋制劑最重要的輔料之一，也是一種能夠有效延緩親水性藥物釋放的重要膜控材料[6-7]。乙基纖維素作為藥用輔料首次收載于《中國藥典》（2000版），現(xiàn)行為《中國藥典》（2020版）[8]。采用甲基苯并噻唑酮腙鹽酸鹽溶液對乙醛進(jìn)行衍生化后，通過標(biāo)準(zhǔn)比色法來控制其含量，方法操作復(fù)雜，專屬性不強，且無法體現(xiàn)待測樣品中乙醛殘留量的相關(guān)數(shù)據(jù)，不利于評價工藝控制水平。自2010年版《中國藥典》起，特別強調(diào)輔料的安全性評估。藥用輔料作為制劑的重要組成部分，直接影響著藥物制劑的安全性[9]。因此，建立一種專屬準(zhǔn)確的乙基纖維素中乙醛的含量測定方法，有利于控制乙基纖維素中的乙醛雜質(zhì)，以更好地保障乙基纖維素及藥物制劑的安全性。

相關(guān)文獻(xiàn)報道[10-14]，乙醛定量測定的方法有氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法等。離子色譜法由于儀器昂貴，普及性不如氣相色譜法和液相色譜法。由于乙醛的結(jié)構(gòu)中缺少發(fā)色基團(tuán)，在進(jìn)行液相色譜法（紫外檢測器）測定時，需借助衍生化試劑，操作復(fù)雜且衍生化效率可直接影響測定結(jié)果。頂空氣相色譜法是將樣品中的揮發(fā)性組分直接導(dǎo)入氣相色譜儀進(jìn)行分離和檢測，無需前處理，受樣品基質(zhì)干擾小，故本研究選擇頂空氣相色譜法測定藥用輔料乙基纖維素中乙醛的含量，并根據(jù)《測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1-2012》[15]以及其他不確定度評定方法[3，16-18]，對測量結(jié)果進(jìn)行不確定度評定。本文通過建立數(shù)學(xué)模型，系統(tǒng)分析了不確定度的來源，并對各個分量進(jìn)行評估和合成，以獲得影響測量結(jié)果準(zhǔn)確性的因素。

1 材料

1.1 藥品與試劑

乙基纖維素（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20140409）；乙醛（中國食品藥品檢定研究院，批號190159-201802，純度99.3%）；氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20180509，分析純）；實驗用水為純化水。

1.2 主要儀器

7890B氣相色譜儀（美國安捷倫公司，Agilent Open Lab Acquisition 2.4工作站，配置安捷倫7697A頂空進(jìn)樣器）；XS205DU電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Milli-Q純水儀（密理博公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-INNOWAX石英毛細(xì)管柱（30m×0.32mm，0.5μm）；程序升溫：起始溫度為40℃，保持5min，以10℃/min的速率升至200℃，保持5min；進(jìn)樣口溫度：200℃；分流比：10∶1；檢測器：氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度250℃；載氣：高純氦氣，流速1.0ml/min；頂空進(jìn)樣平衡溫度：80℃，平衡時間：30min，進(jìn)樣時間：1min。

2.2 溶液配制

對照品溶液：精密稱定乙醛100mg，置于100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述乙醛溶液10ml，置于100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取儲備液5ml，置于100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密量取對照品溶液5ml，置于20ml頂空瓶中，加入氯化鈉1g，加蓋密封，輕輕振搖3min，即得。

樣品溶液：精密稱定乙基纖維素0.25g，置于20ml頂空瓶中，加入氯化鈉1g，精密量取水5ml加入頂空瓶中，加蓋密封，輕輕振搖3min，即得。

空白溶液：取氯化鈉1g，置于20ml頂空瓶中，精密量取水5ml加入20ml頂空瓶中，加蓋密封，輕輕振搖3min，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性考察

按照“2.2”項下制備空白溶液、對照品溶液和樣品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別測定并記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。乙醛峰與相鄰雜峰完全分離，空白溶液和樣品溶液中的其他雜峰對乙醛的測定無干擾。

圖1 氣相色譜圖

2.3.2 精密度考察

按照“2.2”項下方法制備對照品溶液6份，連續(xù)進(jìn)樣并記錄乙醛峰面積。結(jié)果提示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation, RSD） 為 1.84%，提示儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察

按照“2.2”項下方法平行配制6份樣品溶液，進(jìn)樣后記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算乙醛的含量。見表1。

表1 重復(fù)性考察結(jié)果 n=6

2.3.4 線性關(guān)系考察

按照“2.2”項下方法，精密量取10、5、1、0.5ml和0.2ml對照品儲備液，分別置于100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。按對照品溶液配制方法，進(jìn)樣測定，以乙醛質(zhì)量濃度x（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=8.7866x-0.0684，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9992，表明乙醛在0.24～12.05 μ g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 定量限和檢測限

按照“2.2”項下方法，配制乙醛對照品溶液，逐級稀釋，測定并記錄峰面積。定量限（limit of quantitation，LOQ） 為 0.24μg/ml（ 信 噪 比約為10∶1）；檢測限（limit of detection，LOD）為0.12μg/ml（信噪比約為 3∶1）。

2.3.6 加標(biāo)回收率

取乙基纖維素0.12g，精密稱定，置于20ml頂空瓶中，加入氯化鈉1g，平行制備9份，分為低、中、高3組，每組3份；分別精密加入乙醛對照品溶液1.5、2.5ml和3.5ml，再依次加入水3.5、2.5ml和1.5ml，加蓋密封，輕輕振搖3min，進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算。見表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果 n=9

2.4 測量不確定度評定

2.4.1 數(shù)學(xué)模型的建立

本研究采用外標(biāo)法計算乙基纖維素中乙醛的含量，計算公式如下：

ms（mg）：對照品的稱樣量；Cs%：對照品的百分含量，99.3%；msample（mg）：樣品的稱樣量；Asample：樣品中乙醛的峰面積；Vsample：樣品的稀釋倍數(shù)；As：對照品中乙醛的峰面積；Vs：對照品的稀釋倍數(shù)。

2.4.2 不確定度的來源分析

根據(jù)實驗操作步驟和數(shù)學(xué)模型，得到氣相色譜法測定乙基纖維素中乙醛含量的不確定度來源因果圖，見圖2。

圖2 不確定度分量來源因果圖

2.4.2.1 對照品制備引入的不確定度

使用XS205DU電子天平（萬分之一天平）稱量對照品，最大允許誤差為±0.5mg，服從矩形分布，取，則對照品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

對照品的稀釋過程使用100ml量瓶3次，10ml移液管1次，5ml移液管2次。根據(jù)《常用玻璃量器：JJG196-2006 》[19]規(guī)定，20℃時，100ml A級量瓶的容量允許誤差為±0.10ml，概率分布按矩形分布，取，則100ml量瓶允許誤差引起的不確定度分量為定容在（20±5）℃進(jìn)行，已知水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，則體積變化為100×2.1×10-4×5=0.105ml。按均勻分布考慮，取，則溫度引起的不確定度分量為因此100ml量瓶產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

以此類推，10ml移液管允許誤差為±0.02ml，產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為而5ml移液管允許誤差為±0.015ml，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.4.2.2 樣品制備引入的不確定度

按照“2.2”項下制備樣品溶液，使用萬分之一天平稱量樣品250mg，，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為稀釋過程中使用5ml移液管的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V5）=0.001 835。因此樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4.2.3 氣相色譜儀引入的不確定度

氣相色譜儀器的進(jìn)樣精密度會對每次測量結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，因此校正因子測定時引入的不確定度應(yīng)考慮在內(nèi)。在“2.3.2”項下經(jīng)過考察儀器的進(jìn)樣精密度，得到乙醛峰面積分別為50.2575、49.7476、49.3569、49.6157、51.9914 和 50.1451，計算平均值為50.1857，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9456，因此氣相色譜儀測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4.2.4 重復(fù)性測定引入的不確定度

在“2.3.3”項下考察了樣品測定的重復(fù)性，6次樣品測定得到乙基纖維素中乙醛含量的平均值為，標(biāo)準(zhǔn)偏差為S=0.000 0974，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.3 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在“2.4.2”項下各分量的不確定度來源彼此獨立不相關(guān)，合成各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，其中，由重復(fù)性測定貢獻(xiàn)了最大不確定度分量為0.013 25。

綜上，則采用氣相色譜法測定乙基纖維素中乙醛含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u=0.0161×0.003=0.000 048%。取擴展因子k=2，則擴展不確定度為U=0.000 048×2=0.0001%。乙基纖維素中乙醛含量的結(jié)果：乙醛 %=（0.003±0.0001）%，k=2。

3 討論

本研究前期通過考察HP-5（30m×0.32mm，0.25μm）、HP-INNOWAX（30m×0.32mm，0.5μm）、DB-WAX（30m×0.32mm，0.5μm）3種色譜柱發(fā)現(xiàn)，HP-5無法分離乙醛和相鄰雜峰，DB-WAX峰形矮胖且靈敏度差，而HPINNOWAX獲得的乙醛色譜峰峰形最為對稱且尖銳，故選擇HP-INNOWAX色譜柱用于本實驗方法。

由于樣品中其他雜峰較多，當(dāng)起始溫度為50℃時，乙醛峰無法與相鄰雜峰完全分離；當(dāng)起始柱溫為40℃時，目標(biāo)峰在5min內(nèi)流出色譜柱?？紤]到其他高沸點雜質(zhì)，本實驗方法選用5min后采用程序升溫，使其他雜峰流出色譜系統(tǒng)，避免對連續(xù)進(jìn)樣造成干擾。

取70℃、80℃、20min、30min交叉組合進(jìn)樣，考察頂空進(jìn)樣的時間和溫度。結(jié)果表明在80℃條件下平衡30min得到的乙醛峰面積最大。為提高分析靈敏度，在水樣頂空處理過程中加入適量無機鹽，對不加氯化鈉、加氯化鈉1g、加氯化鈉2g 3種條件進(jìn)行比較。結(jié)果表明，加氯化鈉后，乙醛峰明顯增高，而加氯化鈉1g和2g并無明顯差異，故本實驗方法選擇加氯化鈉1g。

4 結(jié)語

本文通過建立氣相色譜測定乙基纖維素中乙醛含量的方法，完善了現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法操作簡單，數(shù)據(jù)科學(xué)、準(zhǔn)確。對測定結(jié)果進(jìn)行了不確定度評定，結(jié)果顯示，重復(fù)性測定為最主要分量。提示實驗中應(yīng)規(guī)范操作，盡量減小人員帶來的隨機誤差。