一測(cè)多評(píng)法測(cè)定首薈通便膠囊中4種大黃素類成份含量

馬云，韓振明，馬健，張微，關(guān)永霞，張貴民

1魯南厚普制藥有限公司，臨沂 276006；2中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，臨沂 276006；3魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，臨沂 276006

首薈通便膠囊由何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術(shù)、枳實(shí)共8味中藥組成，可養(yǎng)陰益氣、瀉濁通便，臨床上主要用于治療功能性便秘及中醫(yī)辨證屬氣陰兩虛兼毒邪內(nèi)蘊(yùn)證者，可全面改善胃腸功能，適合老年人和體質(zhì)虛弱者服用[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，首薈通便膠囊中的8種藥材均具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多重藥理活性[3-5]。其中，何首烏目前已知分離出100多種成份，如大黃酚、大黃素等。大黃酚能有效促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)，防止便秘；蘆薈中所含蘆薈苷、蘆薈大黃素等活性成份具有通便、抗炎、抗病毒、抗菌、保護(hù)肝臟和神經(jīng)等藥理活性；決明子中含有大黃素、大黃酸、大黃酚、橙黃決明素、決明子苷等，具有降血脂的生物活性；枸杞子主要含枸杞多糖、甜菜堿、枸杞色素，枸杞多糖是一種水溶性多糖，是枸杞中最主要的活性成份，能促進(jìn)免疫、抗衰老、抗腫瘤、清除自由基、抗疲勞、抗輻射、保肝；阿膠富含豐富的蛋白質(zhì)，如賴氨酸、蘇氨酸、明膠、精氨酸、組氨酸以及微量元素，在抗腫瘤、促進(jìn)骨愈合以及促進(jìn)造血功能等方面均有明顯效果；人參主要活性成份有人參皂苷和多糖，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等均有調(diào)節(jié)作用；白術(shù)主要化學(xué)成份有揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯類等，如白術(shù)內(nèi)酯、白術(shù)多糖、苷類、氨基酸等，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)等藥理作用；枳實(shí)中同樣已分離出多種化學(xué)成份，如黃酮苷類、生物堿、揮發(fā)油等，具有調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)、保護(hù)胃腸道、降脂、保護(hù)心血管、抗癌、免疫調(diào)節(jié)的藥理作用。8味中藥的多種活性成份可在臨床治療中達(dá)到協(xié)同作用[6-7]。

首薈通便膠囊的現(xiàn)行檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要以薄層色譜法鑒別制劑中人參、枳實(shí)、蘆薈、阿膠4種藥材，同時(shí)采用HPLC法測(cè)定制劑中何首烏的2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、枳實(shí)的柚皮苷含量。多指標(biāo)多成份同時(shí)測(cè)定已成為綜合評(píng)價(jià)中藥處方制劑質(zhì)量的主要研究方向，但活性成份標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的消耗一定程度上限制了其發(fā)展。一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）可以某一種對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)參照物，實(shí)現(xiàn)多種成份同步測(cè)定，目前已應(yīng)用于多種中藥材、中藥制劑的品質(zhì)評(píng)價(jià)[8-9]?；诖?，本研究擬建立以大黃酚為內(nèi)標(biāo)參照物的QAMS，并對(duì)首薈通便膠囊中活性成份的含量進(jìn)行測(cè)定，以優(yōu)化首薈通便膠囊處方制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法，達(dá)到降本增效的目的。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（包括DAD檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、AgilentOpen Lab色譜工作站，安捷倫科技有限公司）；Waters高效液相色譜儀（包括e2695四元泵、2998二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司）；LE204E電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；01193-YP601N電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘆薈苷A（aloin A，批號(hào)：110787，純度≥98%）、蘆薈苷B（aloin B，批號(hào)：110788，純度≥98%）、蘆薈大黃素（aloe emodin，批號(hào)：110775，純度≥97%）、大黃酚（chrysophanol，批號(hào)：110796，純度≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇（色譜純）、磷酸（色譜純）均購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司；甲醇（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；有機(jī)濾頭（孔徑0.22μm，愛(ài)西默科技有限公司）；純水。實(shí)驗(yàn)用14批首薈通便膠囊樣品由魯南厚普制藥有限公司提供，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 首薈通便膠囊樣品信息表

續(xù)表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備

取首薈通便膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取樣品粉末0.5g，精密稱定，置于50ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50ml，密塞，稱重，超聲處理（功率250W，頻率100Hz）60min，放冷至室溫，再次稱重，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，靜置，吸取上清液，0.22μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚對(duì)照品各適量，用50%甲醇溶解并制成濃度分別為0.8010、2.9365、0.1760、0.0880mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以50%甲醇稀釋，制成每1ml含蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚分別為0.0801、0.5873、0.0176、0.0088mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX XDB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（見(jiàn)表2）；柱溫為30℃；流速為1.0ml/min；進(jìn)樣量為5μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。理論板數(shù)按大黃酚計(jì)算不得低于5000。色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 洗脫梯度

圖1 對(duì)照品（A）和供試品（B）的HPLC圖

2.3 線性關(guān)系

分別取上述混合對(duì)照品溶液不同體積，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚4種成份在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)表3。

表3 4種活性成份線性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并分析。結(jié)果蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚的平均峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：200101）粉末6份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。各組份RSD均小于2.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

表4 4種活性成份重復(fù)性試驗(yàn)含量測(cè)定結(jié)果

續(xù)表

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：200101）0.5g，精密稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、48h進(jìn)樣，測(cè)得蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚峰面積的RSD均小于2.0%，表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表5。

表5 4種活性成份穩(wěn)定性試驗(yàn)峰面積測(cè)定結(jié)果

續(xù)表

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品粉末6份，分別準(zhǔn)確加入含有等量各組份對(duì)照品的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各組份回收率的RSD均小于4.0%，詳見(jiàn)表6。

表6 4種活性成份加樣回收率試驗(yàn)

續(xù)表

2.8 相對(duì)校正因子與相對(duì)保留值的確定

2.8.1 相對(duì)校正因子（fk/s）的計(jì)算

采用多點(diǎn)校正法，以多個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)計(jì)算所得平均值為fk/s。校正因子計(jì)算公式為fk/s=（As×Ck）/（Ak×Cs）（公式1）；待測(cè)成份質(zhì)量濃度計(jì)算公式為Ck’=（fk/s×Cs×Ak’）/As（公式 2）。式中As為內(nèi)標(biāo)參照物色譜峰峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)參照物的質(zhì)量濃度，Ak為待測(cè)組份色譜峰峰面積，Ck為待測(cè)組份的質(zhì)量濃度。詳見(jiàn)表7。

表7 多點(diǎn)校正法計(jì)算各成份相對(duì)校正因子

2.8.2 相對(duì)保留值的計(jì)算

以大黃酚色譜峰的保留時(shí)間為參照，計(jì)算各待測(cè)組份的相對(duì)保留值（relative reserved time，RRT），計(jì)算公式為RRT=Tk/Ts（公式3），式中Ts為內(nèi)標(biāo)參照物保留時(shí)間，Tk為待測(cè)組份保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 多點(diǎn)校正法計(jì)算各成份相對(duì)保留值

2.8.3 耐用性評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)考察了不同色譜系統(tǒng)、色譜柱、試驗(yàn)時(shí)間、操作人員對(duì)fk/s與RRT的影響，結(jié)果見(jiàn)表9和表10。由表可知，不同考察條件下各活性成份fk/s的RSD均小于3.0%，相對(duì)保留值的RSD均小于5.0%，表明在試驗(yàn)所考察的各因素范圍內(nèi)均可準(zhǔn)確測(cè)定各成份的含量。

表9 相對(duì)校正因子的耐用性試驗(yàn)

表10 相對(duì)保留值的耐用性試驗(yàn)

2.9 樣品含量測(cè)定

2.9.1 QAMS與外標(biāo)法（external standard method，ESM）測(cè)定含量的結(jié)果比較

取14批首薈通便膠囊內(nèi)容物供試樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別通過(guò)QAMS、ESM進(jìn)行含量計(jì)算，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，詳見(jiàn)表11。結(jié)果表明，不同計(jì)算方法得到4種活性成份含量的RSD均小于3%。

表11 樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

2.9.2 多點(diǎn)校正理論保留時(shí)間與ESM法實(shí)際保留時(shí)間比較

將14批首薈通便膠囊供試品通過(guò)多點(diǎn)校正因子計(jì)算的理論保留時(shí)間與ESM的實(shí)際保留時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果無(wú)顯著差異，見(jiàn)表12。

表12 4種成份的理論保留時(shí)間與實(shí)際保留時(shí)間比較 min

續(xù)表

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑（70%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇）、稱樣量（0.25、0.50、1.00g）、溶劑體積（25、50、100ml）以及超聲處理時(shí)間（30、60、90min）對(duì)樣品含量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)提取方法為稱樣量0.50g、溶劑體積50ml、50%甲醇提取、超聲處理60min時(shí)，樣品色譜圖峰面積適中，因此確定該條件作為本實(shí)驗(yàn)的樣品提取方法。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了首薈通便膠囊中4種活性成份的含量，其中蘆薈苷A與蘆薈苷B是同分異構(gòu)體，可相互轉(zhuǎn)化，且一定條件下均可氧化分解生成蘆薈大黃素以及其他成份，在現(xiàn)有檢測(cè)方法中，蘆薈苷A與蘆薈苷B均以蘆薈苷計(jì)，且實(shí)際檢測(cè)中常存在分離度低的情況，影響色譜峰峰面積的準(zhǔn)確計(jì)算[10]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相中有機(jī)相的比例、pH及洗脫梯度等，最終以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)蘆薈苷A與蘆薈苷B的分離度最好。

本研究基于HPLC建立了以大黃酚為內(nèi)標(biāo)參照物的QAMS定量分析方法，可用于首薈通便膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)。以大黃酚為對(duì)照，首薈通便膠囊內(nèi)容物中3種活性成份的相對(duì)fk/s分別為3.65、4.29、0.77，RRT分別為0.83、0.86、0.97。14批供試品中，ESM與QAMS的含量計(jì)算結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明QAMS測(cè)定結(jié)果可靠。本研究所建立的QAMS具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷、成本低等特點(diǎn)，可較全面地反映首薈通便膠囊的內(nèi)在質(zhì)量，且檢測(cè)成本和檢測(cè)時(shí)間均大幅降低。該方法可用于首薈通便膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)，也為其他中藥處方制劑的質(zhì)量控制提供了一定參考，有利于提高中藥處方制劑的質(zhì)量控制水平。