發(fā)酵蔬菜中生物胺控制技術(shù)研究進(jìn)展

王馨蕊，湯回花，劉畢琴，陳駿飛，趙楠，史巧*，李宏*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650000；2.云南省發(fā)酵蔬菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 紅河 654300；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610000）

發(fā)酵是蔬菜加工的一種主要形式。蔬菜經(jīng)發(fā)酵后風(fēng)味獨(dú)特，但同時(shí)可能產(chǎn)生一定的有害代謝產(chǎn)物，這些有害代謝產(chǎn)物會對消費(fèi)者的健康造成一定的危害。生物胺是發(fā)酵蔬菜中主要存在但易被忽視的有害代謝產(chǎn)物之一。隨著人們對健康食品需求的日益提升，對發(fā)酵蔬菜的安全性及生物胺含量的控制提出了更高要求。因此如何有效控制發(fā)酵蔬菜中生物胺的含量已成為發(fā)酵蔬菜加工研究的關(guān)鍵方向之一。本文結(jié)合食品中生物胺的危害及限量，重點(diǎn)闡述通過微生物酶解法、菌株篩選控制法及發(fā)酵工藝控制法等控制發(fā)酵蔬菜中生物胺技術(shù)的最新研究進(jìn)展，并展望未來的發(fā)展趨勢，以期為發(fā)酵蔬菜加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 食品中生物胺的危害

生物胺是一類分子量低、堿性弱的含氮化合物，包括單胺（酪胺、苯乙胺、色胺、組胺），二胺（腐胺、尸胺）和多胺（精胺、亞精胺）。適當(dāng)濃度的生物胺在人體正常生理活動中發(fā)揮著一定作用，如參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、生成蛋白質(zhì)前體等[1]。當(dāng)人體氨基酸攝入充足時(shí)，生物胺可通過生物合成及分解代謝維持正常濃度，無需外源補(bǔ)充。生物胺攝入過量將引起一系列不良反應(yīng)。蔬菜在發(fā)酵過程中可生成高濃度的生物胺[2]。由于蔬菜本身存在或污染了含氨基酸脫羧酶的微生物，這些微生物利用蔬菜中的游離氨基酸，經(jīng)脫羧反應(yīng)可生成大量的生物胺。組胺和酪胺被歐盟食品安全局認(rèn)為是毒性最大的兩種生物胺。組胺是造成近年食源性生物胺中毒的主要因素之一，一次性攝入8 mg～40 mg的組胺即會引起人體輕度中毒，超過40 mg將引發(fā)中度中毒，超過100 mg將出現(xiàn)嚴(yán)重中毒癥狀[3]。酪胺對人體有直接毒害作用，口服酪胺超過100 mg會引起偏頭痛，超過1 080 mg則會引起中毒性腫脹[4]。尸胺與腐胺具有的強(qiáng)烈惡臭，會對食品風(fēng)味造成影響，它們毒性雖然相對較小，但其能與食物中的亞硝酸鹽結(jié)合生成具有較強(qiáng)致癌性的亞硝胺類物質(zhì)；同時(shí)它們較單胺更易被腸道吸收，會競爭性抑制單胺（組胺和酪胺）的胺氧化代謝,從而增加單胺的毒性。對于服用單胺氧化酶抑制劑藥物的患者，少量生物胺就會引發(fā)食物中毒，而單胺氧化酶抑制劑是治療抑郁癥的一類主要藥物，現(xiàn)代生活壓力下逐年增加的抑郁癥患者可能成為生物胺中毒潛在人群。我國部分人群存在用餐時(shí)飲酒的習(xí)慣，吸煙人群也占很大比例，煙、酒會加強(qiáng)生物胺的毒性，在許多食物中毒案例中不可忽視酒精及吸煙對生物胺毒性的加強(qiáng)作用。對敏感個(gè)體來說，更需要考慮食品中生物胺帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)。

2 食品中生物胺的限量

一些國家已出臺了關(guān)于食品中生物胺的規(guī)定和意見，但針對發(fā)酵蔬菜的相關(guān)規(guī)定目前還很少見。按照美國食藥監(jiān)局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的規(guī)定，食物中總生物胺含量應(yīng)在1000mg/kg以下，同時(shí)對食品中的組胺（≤500 mg/kg）、酪胺（≤100 mg/kg）、β-苯乙胺（≤30 mg/kg）及進(jìn)口水產(chǎn)品中的組胺（≤50 mg/kg）含量均作了規(guī)定。歐盟對食品中組胺及酪胺的限定值分別為100 mg/kg、100 mg/kg～800 mg/kg；同時(shí)建議健康個(gè)體每餐攝入組胺的含量不超過50mg、酪胺不超過600mg，如服用第三代單胺氧化酶抑制劑藥物的個(gè)體酪胺攝入量不超過50 mg、服用傳統(tǒng)單胺氧化酶抑制劑藥物的個(gè)體酪胺攝入量不超過6 mg。英國企業(yè)規(guī)定產(chǎn)品中的組胺不得高于100 mg/kg。以色列規(guī)定水產(chǎn)品、煙熏魚和冷凍魚制品中的組胺不超過200 mg/kg[5]。有研究者建議德國泡菜中腐胺應(yīng)控制在50 mg/kg以下[6]。我國對發(fā)酵蔬菜的生物胺限量還沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)，對青皮紅肉海水魚類產(chǎn)品中生物胺的要求為≤400 mg/kg，而其他海水魚組胺含量應(yīng)≤200 mg/kg。

乙醇能加強(qiáng)生物胺的毒性，因此酒中生物胺含量在各個(gè)酒類主產(chǎn)國都有較普通食品更為嚴(yán)苛的標(biāo)準(zhǔn)，例如德國≤2 mg/L、荷蘭≤3.5 mg/L、比利時(shí)≤5 mg/L、法國≤8 mg/L、澳大利亞和瑞士≤10 mg/L[7]。

3 控制發(fā)酵蔬菜生物胺的意義

由于食品中的生物胺易被忽視，在酒精、抗抑郁藥物等多種因素的影響下，少量攝入即可能引起食物中毒，國外對食品中生物胺含量的關(guān)注日益增加。Kim等[8]研究發(fā)現(xiàn)，韓國泡菜中總生物胺含量超過1 000 mg/kg，而組胺、腐胺的量均大于100 mg/kg。德國卷心菜中腐胺達(dá)108.9 mg/kg，總生物胺含量為241.16 mg/kg[9]。泡菜、酸菜等各類發(fā)酵蔬菜也是我國居民飲食的重要組成部分，隨著人們對食品營養(yǎng)健康要求的日益提高，發(fā)酵蔬菜中如亞硝酸鹽、生物胺等有害代謝產(chǎn)物受到廣泛關(guān)注，時(shí)常出現(xiàn)的產(chǎn)品有害代謝產(chǎn)物超標(biāo)等問題嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的購買意愿，甚至一定程度上制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。發(fā)酵蔬菜中過量的生物胺不利于人體健康，但由于發(fā)酵蔬菜品種的多樣化，加工原料、工藝等的差異化，生物胺種類、含量往往區(qū)別較大，因此要規(guī)定發(fā)酵蔬菜中生物胺的準(zhǔn)許殘留量存在一定難度。Liu等[10]對378個(gè)東北酸菜樣品中的酪胺、腐胺、尸胺含量進(jìn)行了測定，其平均含量分別為203.7、159.6、76.9 mg/kg。瞿鳳梅等[11]檢測了30種市售泡菜樣品，發(fā)現(xiàn)其中腐胺的平均含量（175.7 mg/kg）最高，其次為組胺、色胺和尸胺。邢茜等[4]發(fā)現(xiàn)市售發(fā)酵蔬菜中尸胺、腐胺、酪胺的含量最高分別為246.62、165.9、112.6 mg/kg。郭曉麗等[12]測定的26種醬腌菜樣品中，總生物胺含量最高達(dá)到692.82 mg/kg，腐胺及尸胺的最高含量分別為353.9、269.2 mg/kg。不同種類發(fā)酵蔬菜中生物胺的形成原因、變化規(guī)律存在差異，雖然現(xiàn)階段在限量上難以統(tǒng)一，還未有明確規(guī)定，但生物胺在發(fā)酵蔬菜中的食品安全隱患是存在的，應(yīng)對其加以控制，以提高發(fā)酵蔬菜這一世界性傳統(tǒng)食品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，推動發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)向保證人體健康、兼具風(fēng)味與安全的方向發(fā)展。

4 發(fā)酵蔬菜生物胺控制技術(shù)

4.1 微生物酶解法

一些微生物中含有胺氧化酶、胺脫氫酶或多銅氧化酶，這些酶類能夠降解生物胺。胺氧化酶可以將生物胺轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?、氨及過氧化氫[7]，胺脫氫酶可使生物胺脫氨生成乙醛和氨[13]，而多銅氧化酶能催化生物胺氧化生成醛、氨和水。胺氧化酶活性受底物、食源性抑制劑和生物胺種類數(shù)量的影響，如在乙醇存在的情況下胺氧化酶活性會受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)12%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇能抑制約91%的胺氧化酶的活力[14]。所以通過胺氧化酶控制酒類中的生物胺并不可行，但發(fā)酵蔬菜中乙醇含量較低，利用微生物中胺氧化酶降解生物胺是可行的。研究者們從各類發(fā)酵食品中分離到了一些具有胺氧化酶活性的微生物，如能夠降解組胺的木糖葡萄球菌、可以降解酪胺的干酪乳桿菌、降解腐胺和尸胺的枯草芽孢桿菌等[13]。以具有胺氧化酶活性的菌株研制發(fā)酵劑，用于蔬菜加工中能有效減少產(chǎn)品中生物胺含量。吳長力等[15]篩選出了一株可降解食品中亞硝酸鹽和生物胺的植物乳桿菌（GDMCC 60413），發(fā)現(xiàn)其對亞硝酸鹽和生物胺的降解率分別為98.32%和49.59%。有研究發(fā)現(xiàn)，從韓國發(fā)酵豆制品中分離到的戊糖片球菌在體外降解組胺和酪胺的能力分別為14.7%～23.7%和 15.7%～25.9%[16]。Kung 等[17]研究表明從味噌中分離的植物乳桿菌能夠降解66.7%～100.0%的組胺。Lee等[18]發(fā)現(xiàn)接種植物乳桿菌作為發(fā)酵劑的味噌較未接種組別，組胺和總生物胺含量分別降低了58%和27%。將胺氧化酶直接添加至食品中降解生物胺的研究也有少量報(bào)道，但發(fā)酵食品的加工環(huán)境條件復(fù)雜，酶活性易受低pH值等因素影響，在發(fā)酵蔬菜中加入胺氧化酶來降低生物胺含量需要綜合考慮各項(xiàng)發(fā)酵條件。有研究者從綠膿假單胞菌、弗式檸檬酸桿菌、Nocardioides simplex中發(fā)現(xiàn)了胺脫氫酶[1]，但這些菌株還未應(yīng)用于發(fā)酵食品中，而且胺脫氫酶的活性易受一些藥物如羰基化合物的抑制[13]。相較于胺氧化酶、胺脫氫酶，多銅氧化酶在低pH值環(huán)境下具有更高的酶活力，已有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌來源的重組多銅氧化酶最適pH值為3.5，在18%的鹽含量下有一定耐受性，更適應(yīng)發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)環(huán)境[19]。雖然對于多銅氧化酶的酶學(xué)特性有一定的研究，但在發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)體系中運(yùn)用還未有深入分析，如應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中去除生物胺還需要進(jìn)一步研究。

4.2 菌株篩選控制法

氨基酸脫羧酶在酸性條件下具有較高活力，其最適pH值為4.0～5.5，當(dāng)發(fā)酵蔬菜中pH值下降到這一范圍時(shí)，具有氨基酸脫羧酶活性的微生物就會利用游離氨基酸，經(jīng)過氨基脫羧作用形成了生物胺，這也是發(fā)酵到一定階段時(shí)產(chǎn)品生物胺含量升高的主要原因之一。乳酸菌是發(fā)酵蔬菜中發(fā)揮作用的主要菌群，而乳酸菌大多具有氨基酸脫羧酶。同種乳酸菌的各個(gè)菌株之間，形成生物胺的能力有所不同，同一種乳酸菌可能存在產(chǎn)生物胺和不產(chǎn)生物胺的不同菌株。篩選無氨基酸脫羧酶活性的菌株研制發(fā)酵劑，接種到蔬菜原料中，將能從源頭上使生物胺得到有效控制，這也是目前最常用的調(diào)控手段。Fang等[20]篩選出了一株棒狀乳桿菌 BBE-H3（CCTCC M2012130），其不產(chǎn)生物胺，并且可以抑制沙克乳桿菌產(chǎn)生物胺，其所產(chǎn)乳酸菌素還具有較廣的抑菌范圍，可抑制雜菌的生長。唐垚等[21]篩選的一株乳酸乳球菌（CGMCC 14932）不產(chǎn)生物胺，而且能抑制其他產(chǎn)生物胺的乳酸菌生長，阻斷生物胺的形成，其還篩選到一株短乳桿菌（CGMCC 12792），具有不產(chǎn)生物胺、耐低溫、抗噬菌體及產(chǎn)酸能力強(qiáng)的特性。謝九艷等[22]從新疆乳制品中分離到的產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（CICC 6287）4種氨基酸脫羧酶活性均為陰性，能夠降解亞硝酸鹽，還可以抑制大腸桿菌等病原菌，應(yīng)用于辣椒發(fā)酵中可有效提高產(chǎn)品的安全性。除乳酸菌外，研究豆類發(fā)酵食品中的芽孢桿菌并開發(fā)為發(fā)酵劑，是有效控制產(chǎn)品生物胺含量的重要方法[23]。從發(fā)酵豆制品中篩選出的芽孢桿菌（Bacillus subtilis HJ0-6、Bacillus subtilis D'J53-4及 Bacillus idriensis RD13-10），不具有組氨酸、酪氨酸脫羧酶基因（hdc、tydc）,不產(chǎn)生組胺、酪胺，而且具有胺氧化酶，能夠降解對應(yīng)的生物胺[24]。制作韓國大醬時(shí)，以低產(chǎn)生物胺的枯草芽孢桿菌[25]、地衣芽孢桿菌[26]為發(fā)酵劑，有效地將產(chǎn)品生物胺含量控制在較低水平。有研究者從傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中篩選原生菌種，研制發(fā)酵劑，從而兼顧典型風(fēng)味和食品安全，為發(fā)酵蔬菜提供技術(shù)參考[27]。

4.3 發(fā)酵工藝控制法

氨基酸脫羧酶是生物胺形成中的關(guān)鍵物質(zhì)，通過優(yōu)化加工工藝，降低氨基酸脫羧酶活性或抑制氨基酸脫羧酶陽性菌的生長，可達(dá)到減少發(fā)酵蔬菜中生物胺積累的目的。研究者們對不同的加工工藝進(jìn)行了試驗(yàn)，如變溫多段發(fā)酵[28]、降低后發(fā)酵溫度[29]、原料滅菌[30]、基因工程調(diào)控及添加抑菌物質(zhì)[31]等方法來綜合控制生物胺的產(chǎn)生和積累。變溫或低溫發(fā)酵還可以結(jié)合如改變酸堿度等環(huán)境條件，以較低的成本共同控制生物胺的產(chǎn)生。低溫環(huán)境可以減緩氨基酸脫羧酶陽性菌生長,10℃時(shí)食品中組胺產(chǎn)生量減少,溫度降低到5℃時(shí)幾乎不再生成。在韓國大醬后端熟制加工時(shí)，烘烤較蒸煮的方式能更顯著地降低大醬中生物胺含量[32]。原料輻照滅菌、基因工程改造發(fā)酵菌、加入化學(xué)添加劑等方法大眾一般不易接受，可以探索通過添加天然抗菌肽、香辛料或有機(jī)酸等方法控制氨基酸脫羧酶陽性菌的生長。有研究者采用有機(jī)酸的方法有效控制了發(fā)酵蔬菜中的生物胺，還能增加產(chǎn)品的風(fēng)味[3]。在韓國泡菜中，配料經(jīng)乙酸或檸檬酸處理的樣本，較未處理樣本組胺含量明顯減少，由90.22 mg/kg下降至16.18 mg/kg[33]。Yücel等[34]發(fā)現(xiàn)在土耳其泡卷心菜中加入檸檬酸能有效降低其生物胺含量。在豆醬加工及貯藏時(shí)添加兒茶素、西柚籽提取物兩種天然食品添加劑，能一定程度上降低產(chǎn)品中8種生物胺的含量[35]。研究者還發(fā)現(xiàn)，乙醇的添加對降低實(shí)驗(yàn)室制腐乳中生物胺的總含量有顯著影響[36]。改變發(fā)酵蔬菜的pH值、含鹽量等這些食品本身的性質(zhì)，將會影響食品的品質(zhì)和感官特性，因此在抑制氨基酸脫羧酶活性及其產(chǎn)生菌生長時(shí)，還需要考慮對食品本身品質(zhì)的影響。研究者們還對臭氧處理、壓力處理及包裝改良等不影響產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的生物胺控制工藝技術(shù)進(jìn)行了研究。

5 結(jié)語

我國制作發(fā)酵蔬菜已有幾千年的歷史，在蔬菜加工產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。控制發(fā)酵蔬菜中有害代謝產(chǎn)物，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全，對于該產(chǎn)業(yè)更加健康、長遠(yuǎn)發(fā)展非常關(guān)鍵。發(fā)酵蔬菜的生物胺含量當(dāng)前還沒有限量標(biāo)準(zhǔn)，對于不同種類發(fā)酵蔬菜生物胺形成原因、變化規(guī)律等，還需進(jìn)一步研究。如何控制發(fā)酵蔬菜中生物胺含量，現(xiàn)有技術(shù)仍處于起步階段，發(fā)酵肉制品、水產(chǎn)制品中已有的手段可以借鑒。如接種復(fù)合發(fā)酵劑結(jié)合真空包裝抑制干腌香腸中生物胺形成[37]；利用海藻酸鈉包埋迷迭香提取物，控制鮑魚冷藏過程中的生物胺積累[38]；醋酸腌制后真空包裝，再超高壓處理，抑制發(fā)酵鯡魚生物胺的產(chǎn)生[39]。國內(nèi)研究者在泡菜保藏方面，已研究了真空包裝對產(chǎn)品生物胺含量的影響，發(fā)現(xiàn)真空包裝較傳統(tǒng)的有氧包裝及鹽水包裝能更加有效地抑制泡菜中組胺、酪胺和腐胺的積累，保藏后上述生物胺含量分別為0.19、0.15 mg/kg和0.43 mg/kg[40]?？傮w而言，對于發(fā)酵蔬菜中生物胺的控制，現(xiàn)有技術(shù)還存在一些局限，對企業(yè)規(guī)模、加工設(shè)備等有一定要求，對現(xiàn)有技術(shù)更深入地研究并發(fā)掘新技術(shù)新方法是控制發(fā)酵蔬菜生物胺的一個(gè)研究方向。