高效液相色譜測(cè)定葡萄糖酸鈣片含量和溶出度的方法研究

鄧映明，張 雁，曾玉梅，劉志輝（通信作者）

（梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所化學(xué)室 廣東 梅州 514071）

葡萄糖酸鈣片在臨床上廣泛用于補(bǔ)充鈣質(zhì)，治療鈣缺乏癥，如骨質(zhì)疏松、佝僂病[1-2]以及與其他藥物聯(lián)用用于產(chǎn)后出血、小兒厭食等[3-6]。葡萄糖酸鈣片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2020 年版二部，其含量測(cè)定方法以鈣紫紅素為指示劑，EDTA 滴定液滴定至紫色轉(zhuǎn)變?yōu)榧兯{(lán)，滴定鈣的含量，換算為葡糖糖酸鈣的含量；溶出度采用原子吸收分光光度法測(cè)定其溶出量，原子吸收分光光度法重現(xiàn)性較差?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道葡萄糖酸鈣含量測(cè)定方法主要包括電位滴定法、離子色譜法、ICP-OES、ICP-MS等[7-16]，本文基于高效液相色譜技術(shù)對(duì)葡萄糖酸鈣片的含量和溶出度測(cè)定方法進(jìn)行了研究，建立了HPLC 法測(cè)定葡萄糖酸鈣片的含量和溶出度。該方法靈敏度高、不受輔料干擾、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，且成本低，可為該藥品的質(zhì)量控制提供參考。

1.儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀，Agilent 1200 紫外檢測(cè)器；SOTAX 半自動(dòng)溶出儀；磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。葡萄糖酸鈣對(duì)照品（批號(hào)100082-201002，含量：99.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；葡萄糖酸 鈣 片（廠 家A 批 號(hào)：2109031、2109012、2010014，廠 家B 批 號(hào)：77220503、77220203； 廠 家C 批 號(hào)：20211101、20210401，廠家D 批號(hào)：3220512、3220214、3220409，廠家E 批號(hào)：11220607 廠家F 批號(hào)：211201、210609、210104）。

2.方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1色譜條件與溶液制備 （1）色譜條件。色譜柱：安捷倫ZORBAXSB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8），流速0.5 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。（2）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取葡萄糖酸鈣對(duì)照品55.30 mg 于2 5 mL 量瓶中，加水振搖使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液2 mL 置10 mL 中，搖勻，作為對(duì)照品溶液。（3）供試品溶液的制備。取葡萄糖酸鈣片10 片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于葡萄糖酸鈣50 mg），置100 mL 量瓶中，加水30 mL，超聲10 min 使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。（4）陰性樣品溶液的制備。按葡萄糖酸鈣片處方比例（輔料為滑石粉、羧甲基淀粉鈉、蔗糖、硬脂酸鎂），制作除葡萄糖酸鈣外的陰性樣品，并按（2）項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.2 實(shí)驗(yàn) （1）系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)。取對(duì)照溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，按2.1.1 中的（1）項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示供試品溶液主峰保留時(shí)間與對(duì)照品主峰保留時(shí)間一致，理論塔板數(shù)以葡萄糖酸鈣峰計(jì)為15 000 以上。（見(jiàn)圖1）。（2）專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)。分別吸取上述供試品溶液、對(duì)照溶液、含輔料陰性樣品溶液，按照“2.2.1”色譜條件，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性樣品溶液在與葡萄糖酸鈣相應(yīng)的保留時(shí)間處，無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明輔料不干擾葡萄糖酸鈣的測(cè)定，見(jiàn)圖1。（3）線性關(guān)系與檢出限。①分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、5、10 mL 于1 0 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，配制成0.1103、0.2207、0.4414、1.1035、2.207 mg·mL-1的葡萄糖酸鈣系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.②按2.1.1中的（1）色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y = 638.45X+9.0113，r= 0.9996。結(jié)果表明：葡萄糖酸鈣在0.1103 ～2.207 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)線性關(guān)系良好。③量取對(duì)照溶液適量，加流動(dòng)相逐級(jí)稀釋?zhuān)許/N = 3 時(shí)為檢測(cè)限。測(cè)得檢測(cè)限為3.8 ng，以S/N = 10 確定定量限為12.8 ng。（4）精密度試驗(yàn)取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液下濃度為0.220 7 mg·mL-1的對(duì)照溶液，按按2.1.1 中的（1）項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，其峰面積平均值為309.1，RSD 為0.1%。（5）重復(fù)性試驗(yàn)。取廠家B 樣品（批號(hào)：77220503）的葡萄糖酸鈣片，按（3）方法制備樣品進(jìn)樣，平行測(cè)定6 次，平均含量為99.76%，RSD 為0.2%。（6）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取廠家C 樣品（批號(hào)：20211101），制備供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12，24 h 后測(cè)定，葡萄糖酸鈣的峰面積RSD 為0.3%。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液配制好后24 h 內(nèi)穩(wěn)定。（7）回收率試驗(yàn)。稱(chēng)取已知含量的葡萄糖酸鈣片（批號(hào)：2109031，含量：947.12 mg/g）研細(xì)，稱(chēng)取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于葡萄糖酸鈣20、25、30 mg 各3 份）置1 0 0 mL 量瓶中，共9 份，分別精密稱(chēng)取葡萄糖酸鈣對(duì)照品（含量：99.8%，約20、25、30 mg 各3 份）置同一量瓶中，按含量測(cè)定方法測(cè)定含量，結(jié)果平均回收率為100.54%，RSD為0.74%?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。（8）樣品含量測(cè)定精密稱(chēng)取6 各廠家14 批次的樣品細(xì)粉，按供試品溶液項(xiàng)下制備方法制備含量測(cè)定樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行含量測(cè)定，并與容量滴定法進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示兩種方法含量測(cè)定結(jié)果相近，見(jiàn)表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 兩種方法含量測(cè)定結(jié)果比較（n = 3）

圖1 HPLC 色譜圖

2.2 溶出度測(cè)定

2.2.1 測(cè)定方法 取葡萄糖酸鈣片6 片，溶出介質(zhì)為水1 000 mL，漿法，轉(zhuǎn)速為每min50轉(zhuǎn)，溫度為37±0.5 ℃，照溶出度與釋放度測(cè)定法（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則0931），依法操作，經(jīng)45 min，取溶液適量，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為溶出度測(cè)定供試品溶液。

2.2.2 累積溶出量曲線的繪制 取6 片樣品（批號(hào)：2109012），按“2.2.1”方法進(jìn)行操作，分別于10、15、20、30、40、45、50、55 min 時(shí)取樣5 mL（同時(shí)補(bǔ)充溶出介質(zhì)5 mL），濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算溶出量和平均累積溶出量，繪制累積溶出量曲線，測(cè)定結(jié)果表面45 min 后溶出曲線趨于平穩(wěn)，樣品溶出量接近100%，見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄糖酸鈣片溶出曲線

2.2.3溶出度均一性考察 取廠家A 樣品（批號(hào)：2109012），按“2.2.1”方法平行操作6 次，計(jì)算葡糖糖酸鈣平均累積溶出量，繪制其6 次溶出曲線，得溶出均一性結(jié)果，結(jié)果顯示，6 次溶出試驗(yàn)的曲線趨勢(shì)基本相同，至45 min 時(shí)的累積溶出量RSD 為0.85%。見(jiàn)圖3。

圖3 溶出均一性結(jié)果（n = 6）

2.2.4 溶出度測(cè)定 取上述6 個(gè)廠家各1 批次樣品，分別按“2.2.1”方法操作，結(jié)果6 批次樣品在45 min時(shí)的溶出量均大于75%，見(jiàn)表3。

表3 樣品在45 min 時(shí)的溶出量（%）

3.討論

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。葡萄糖酸根有羰基氧和羥基氧上孤對(duì)電子的共軛作用所產(chǎn)生的末端吸收（205～215 nm），波長(zhǎng)210 nm 處溶劑及輔料對(duì)葡萄糖酸鈣的測(cè)定不產(chǎn)生干擾，故選擇210 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相的選擇。葡萄糖酸為有機(jī)酸，極性較大，在反相柱上保留較弱，為增加葡萄糖酸鈣的保留，故采用水性柱和純水相作為流動(dòng)相，由于磷酸鹽在紫外區(qū)幾乎無(wú)吸收，故選擇緩沖液；緩沖液的pH 對(duì)葡萄糖酸鈣的峰形影響較大，pH 較大時(shí)，葡萄糖酸發(fā)生酸式解離，造成峰拖尾，pH 減小由于抑制了葡萄糖酸的解離，峰形變銳，有利于準(zhǔn)確定量；本實(shí)驗(yàn)采用了0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（pH = 2.8）作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，葡萄糖酸峰峰形好，柱效高，保留時(shí)間合適。

提取方法的選擇。采用流動(dòng)相作為提取溶劑有利于充分提取葡萄糖酸鈣，但是葡萄糖酸鈣溶液不穩(wěn)定，30 min 后會(huì)發(fā)生降解。根據(jù)葡萄糖酸鈣在水中緩緩溶解的物理性質(zhì)，可采用簡(jiǎn)便、快速的超聲提取的方式，該方式同樣可以充分提取葡萄糖酸鈣，且葡萄糖酸鈣水溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。