番茄紅素對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移、成管能力的影響觀察及其機(jī)制探討

陳俊求，蔡潔娜，劉強(qiáng)，熊龍根

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，廣州 510000；2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院深圳醫(yī)院心內(nèi)科；3 廣東省普寧市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。ˋSCVD）的病理基礎(chǔ)，對(duì)AS 發(fā)生發(fā)展以及調(diào)控機(jī)制的研究是心腦血管疾病防治的重要一環(huán)。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙被認(rèn)為是AS 發(fā)病機(jī)制中最重要的事件，因此通過(guò)減輕血管內(nèi)皮損傷來(lái)防治ASCVD 是一種可行的策略［1］。內(nèi)皮細(xì)胞功能失穩(wěn)主要與外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）數(shù)量減少和功能障礙有關(guān)，目前已知氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）—哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）—自噬促進(jìn)AS 形成［2-3］。然而，ox-LDL 是否誘導(dǎo) EPCs 自噬以及誘導(dǎo)EPCs 功能損傷的潛在機(jī)制仍知之甚少。番茄紅素（Lyc）是一種天然類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的抗氧化和抗炎作用，對(duì)高糖或終末糖基化產(chǎn)物誘導(dǎo)的EPCs損傷具有保護(hù)作用，可以通過(guò)激活A(yù)MPK-mTOR 通路激活自噬［4-7］。2020 年 10 月—2021 年 11 月，我們觀察了 Lyc 對(duì) ox-LDL 誘導(dǎo)的 EPCs 細(xì)胞增殖、遷移、成管能力的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 EPCs及主要試劑、儀器 EPCs：普寧市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供的健康志愿者外周血來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的晚期EPCs。主要試劑：ox-LDL（北京索萊寶，H7950），Lyc（上海源葉生物，S24983-20 mg），內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM，美國(guó) ScienCell，1001），CCK-8 試劑盒（上海碧云天，C0042），matrigel基質(zhì)膠（美國(guó) BD，356234），AMPK（Abcam 公司，ab131512），p-AMPK（Abcam 公司，ab23875），mTOR（Abcam 公 司 ，ab32028），p-mTOR（Abcam 公 司 ，ab109268），β-Actin（賽維爾，GB11001），LC3B（Abcam 公司，192890），小分子化合物C（CC）（APExBio，B3252）。主要儀器：細(xì)胞生化恒溫孵育箱（美國(guó)Thermo，371），Western blot 電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)，1658033），凝膠成像顯影儀（美國(guó)Thermo，E-Gel），超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈，SW-CJ-iFD），酶標(biāo)儀（瑞士Tecan，F(xiàn)50）。

1.2 EPCs分組、Lyc給予方法以及細(xì)胞增殖活力測(cè)算 采用CCK-8 法。將EPCs 接種至96 孔板，每孔3 000細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。24 h后將細(xì)胞分為4組，分別為 A 組、B 組、C 組、空白組（D 組）。A 組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基和ox-LDL（10 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后棄去上清，再加入含10%胎牛血清和 Lyc（10 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h；B 組加入含10%胎牛血清和ox-LDL（100 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；C 組加入含 10%胎牛血清和 Lyc（10 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；D 組細(xì)胞加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。細(xì)胞處理結(jié)束后收集細(xì)胞，CCK8試劑盒取出平衡至室溫30 min，每孔加100 μL 的ECM 與CCK8（按1 000∶100 比例）混合液。放回培養(yǎng)箱中孵育1～3 h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)液檢測(cè)450 nm 處的OD 值，計(jì)算細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞增殖活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.3 EPCs 分組、Lyc 給予方法以及細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑測(cè)算 分組方法同“1.2”。細(xì)胞鋪滿板底后，用1 mL 槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，清洗后加入無(wú)血清ECM，鏡下觀察并拍照記錄，放回入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 和48 h 鏡下觀察并拍照記錄，以劃痕愈合率（%）評(píng)價(jià)遷移能力。細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)：預(yù)冷 96 孔板，每孔加入 50 μL 的 Matrigel，每孔加入 100 μL 濃度為 4×105/mL 細(xì)胞，24 h 和48 h 后鏡下觀察，以形成小管直徑（mm）評(píng)價(jià)成管能力。

1.4 EPCs分組、Lyc給予方法以及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blot 法。分組方法同“1.2”。收集EPCs提取蛋白樣品鑒定，電泳、轉(zhuǎn)膜后予以抗體孵育，本次檢測(cè)的主要是自噬接頭蛋白（P62）、微管相關(guān)輕鏈蛋白3（LC3）的剪切成分LC3-1、LC3-Ⅱ及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和信號(hào)通路蛋白（MAPK，mTOR）表達(dá)情況，一抗、二抗孵育結(jié)束后予以顯影，用image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，并計(jì)算目標(biāo)條帶與β-actin 的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR 的比值分別表示AMPK、mTOR蛋白的磷酸化水平，以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，以ox-LDL+Lyc處理時(shí)LC3-Ⅱ的表達(dá)水平評(píng)估細(xì)胞自噬水平。

1.5 EPCs 分組、CC 給予方法以及細(xì)胞增殖活力測(cè)算 采用CCK-8 法。將EPCs 接種至96 孔板，每孔3 000細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。24 h后將細(xì)胞分為4組，分別為 E 組、F 組、G 組、H 組。E 組首先加入含 10%胎牛血清和CC的培養(yǎng)基溫箱孵育30 min，然后加入含10%胎牛血清和ox-LDL（10 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后棄去上清，最后再加入含10%胎牛血清和 Lyc（10 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h；F 組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基和ox-LDL（10 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后棄去上清，再加入含10%胎牛血清和 Lyc（10 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h；G 組加入含10%胎牛血清和ox-LDL（100 mg/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；H 組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。細(xì)胞處理結(jié)束后收集細(xì)胞，CCK8 試劑盒取出平衡至室溫 30 min，每孔加 100 μL 的 ECM 與 CCK8（按1 000∶100 比例）混合液。放回培養(yǎng)箱中孵育1～3 h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)液檢測(cè)450 nm 處的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞增殖活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD值）×100%。

1.6 EPCs 分組、CC 給予方法以及細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑測(cè)算 分組方法同“1.5”。細(xì)胞鋪滿板底后，用1 mL 槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，清洗后加入無(wú)血清ECM，鏡下觀察并拍照記錄，放回入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h和48 h鏡下觀察并拍照記錄，以劃痕愈合率（%）評(píng)價(jià)遷移能力。細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)：預(yù)冷 96 孔板，每孔加入 50 μL 的 Matrigel，每孔加入100 μL 濃度為4×105/mL 細(xì)胞，24 h和48 h后鏡下觀察，以形成小管直徑（mm）評(píng)價(jià)成管能力。

1.7 EPCs 分組、CC 給予方法以及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blot 法。分組方法同“1.5”。收集EPCs 提取蛋白樣品鑒定，電泳、轉(zhuǎn)膜后予以抗體孵育，本次檢測(cè)的主要是自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、微管相關(guān)輕鏈蛋白3（LC3）的剪切成分LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ、自噬接頭蛋白（P62）以及信號(hào)通路蛋白（MAPK、mTOR）表達(dá)情況，一抗、二抗孵育結(jié)束后予以顯影，用image J 軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，以βactin 作為內(nèi)參，并計(jì)算目標(biāo)條帶與β-actin 的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR的比值分別表示AMPK、mTOR 蛋白的磷酸化水平，以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表示LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，以ox-LDL+Lyc 處理時(shí)LC3-Ⅱ的表達(dá)水平評(píng)估細(xì)胞自噬水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 和R4.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間單一協(xié)變量間比較采用one-way ANOVA 分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較 細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較（）

表1 各組細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較（）

注：與B組比較，*P＜0.05。

組別A組B組C組D組形成小管直徑（mm）0.92±0.02*0.59±0.01 0.99±0.01 1.00±0.05*細(xì)胞增殖活力（%）74.01±5.59*53.73±2.78 107.10±5.03 100.00±5.91*細(xì)胞劃痕愈合率（%）0.25±0.03*0.17±0.01 0.26±0.04 0.28±0.05*

2.2 各組細(xì)胞p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2 各組細(xì)胞p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與B組比較，*P＜0.05。

組別A組B組C組D組LC3-Ⅱ1.91±0.17*1.31±1.19 0.96±0.07 1.00±0.07*p62 1.41±0.02*1.85±0.09 0.95±0.05 1.00±0.12*Beclin-1 4.08±0.17*2.95±0.53 0.96±0.33 1.00±0.36*

2.3 各組細(xì)胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表3 各組細(xì)胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與B組比較，*P＜0.05。

組別A組B組C組D組p-mTOR/mTOR 0.57±0.11*1.29±0.02 0.91±0.05 0.94±0.07*p-AMPK/AMPK 1.00±0.08*0.33±0.01 0.61±0.05 0.58±0.07*

2.4 阻斷AMPK后各組細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較 阻斷AMPK 后細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較見(jiàn)表4。

表4 阻斷AMPK后各組細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較（）

表4 阻斷AMPK后各組細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕愈合率、形成小管直徑比較（）

注：與F組比較，*P＜0.05。

組別E組F組G組H組形成小管直徑（mm）0.11±0.05*0.92±0.14 0.58±0.07*1.00±0.03細(xì)胞增殖活力（%）25.01±0.03*36.41±0.02 24.68±0.01*42.16±0.02細(xì)胞劃痕愈合率（%）0.07±0.02*0.27±0.01 0.17±0.02*0.31±0.07

2.5 阻斷 AMPK 后各組細(xì)胞 p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 阻斷AMPK 后細(xì)胞p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表5。

表5 阻斷AMPK后各組細(xì)胞p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與G組比較，*P＜0.05。

組別E組F組G組H組Beclin-1 1.26±0.16*0.79±0.18 1.34±0.02 1.00±0.16*p62 1.19±0.08*1.57±0.08 1.15±0.07 1.00±0.24*LC3-Ⅱ1.33±0.13*1.86±0.06 1.41±0.06 1.00±0.06*

3 討論

ASCVD 是全球范圍內(nèi)最主要的血管疾病，AS是其病理基礎(chǔ)。雖然抗動(dòng)脈硬化治療的進(jìn)步已經(jīng)使心臟病和腦卒中的病死率顯著下降，但是全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，這種下降在低收入或中等收入國(guó)家呈現(xiàn)非可持續(xù)性［8］。目前，心腦血管病死率的下降主要是腦卒中病死率下降，而ASCVD 的病死率下降幅度并不大，甚至在亞洲某些國(guó)家，報(bào)告的ASCVD病死率甚至有所上升趨勢(shì)［9］，《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020 概要》指出我國(guó)心血管疾病已超過(guò)腫瘤性疾病成為我國(guó)城鄉(xiāng)居民總體死亡原因的首位病因，報(bào)告推算我國(guó)冠心病的現(xiàn)患病人數(shù)約為1 100萬(wàn)，我國(guó)心血管疾病患病人數(shù)總體上仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［10］，因此對(duì)AS發(fā)生發(fā)展以及調(diào)控機(jī)制的研究和探索是心腦血管疾病防治的重要一環(huán)。

AS 的始動(dòng)因素包括低密度脂蛋白膽固醇（LDL）、炎癥以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷：動(dòng)脈長(zhǎng)期累積暴露于LDL 仍然是AS 發(fā)生和進(jìn)展的主要決定因素，ox-LDL 是促動(dòng) AS 的關(guān)鍵［11］，同時(shí) ox-LDL 顆粒的成分會(huì)誘發(fā)炎癥并提供適應(yīng)性免疫的新表位，炎癥反過(guò)來(lái)又可以以驅(qū)動(dòng)AS 的方式改變動(dòng)脈壁細(xì)胞的功能。ox-LDL 處理巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞可以激活NLRP3炎癥小體，隨后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β的分泌，而下調(diào)NLRP3 炎癥小體可提高內(nèi)皮細(xì)胞功能和巨噬細(xì)胞存活，從而抑制AS［3］。這些經(jīng)由危險(xiǎn)因素或疾病介導(dǎo)的系統(tǒng)性全身炎癥以及血管壁細(xì)胞功能損傷引起的局部炎癥（例如損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞激活內(nèi)膜細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子的炎癥過(guò)程）均會(huì)釋放可溶性炎癥介質(zhì)，進(jìn)而觸發(fā)以及加速AS的過(guò)程［12］。除了脂質(zhì)學(xué)說(shuō)和炎性學(xué)說(shuō)，早在 1993 年，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙就被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)病機(jī)制中最重要的事件［13］：內(nèi)皮細(xì)胞暴露于導(dǎo)致AS的風(fēng)險(xiǎn)因素后出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙從而導(dǎo)致脂質(zhì)沉積、免疫炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是AS的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此通過(guò)減輕血管內(nèi)皮損傷來(lái)防治AS是一種可行的策略，而內(nèi)皮細(xì)胞功能失穩(wěn)則主要與外周血 EPCs 數(shù)量減少和功能障礙有關(guān)［2］。EPCs 是在血液中循環(huán)的單核細(xì)胞，來(lái)自不同的組織，表達(dá)類似于成熟內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。EPCs 的發(fā)現(xiàn)為血管修復(fù)和AS 帶來(lái)了新的方向，也為動(dòng)AS 的血管穩(wěn)態(tài)修復(fù)提供了新的理論。來(lái)自骨髓和其他一些器官的EPCs 通過(guò)遷移到遠(yuǎn)處的血管來(lái)幫助血管修復(fù)，在那里它們分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞并替換舊的和受損的內(nèi)皮細(xì)胞。EPCs 修復(fù)血管損傷的能力則取決于它們的數(shù)量和功能［14］，因此如何通過(guò)減少危險(xiǎn)因素對(duì)于EPCs 損傷進(jìn)而維護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能穩(wěn)態(tài)免于ox-LDL 和炎癥的損傷是預(yù)防AS 這一病理過(guò)程的關(guān)鍵步驟之一。

Lyc 是一種天然類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的抗氧化和抗炎作用，能預(yù)防心血管疾病，包括高血脂與AS［15］。已有研究［5-6］報(bào)道，Lyc 對(duì)高糖或糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的EPCs損傷具有保護(hù)作用。Lyc可以通過(guò)激活A(yù)MPK活性抑制炎癥［16］和激活自噬［17］。值得注意關(guān)注的是AMPK激活可在冠心病、糖尿病心肌病、腦卒中等病理過(guò)程中減弱NLRP3 炎性小體的上調(diào)［18-19］。既往研究表明，AMPK/mTOR 信號(hào)通路激活自噬下調(diào)NLRP3炎性小體［20-23］。然而，Lyc是否對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)的EPCs 損傷具有保護(hù)作用及其調(diào)控機(jī)制尚未明確。因此，在本研究擬在體外研究Lyc 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)EPCs 的自噬信號(hào)的影響，并進(jìn)一步探討了Lyc 參與AMPK/mTOR 信號(hào)通路的潛在機(jī)制，為L(zhǎng)yc 治療AS 的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。本研究在細(xì)胞水平上揭示Lyc對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的EPCs增殖、遷移和成管能力的保護(hù)作用：在我們用ox-LDL 誘導(dǎo)刺激EPCs 后出現(xiàn)了EPCs 細(xì)胞增殖能力的下降，遷移能力和成管能力的減退，而在補(bǔ)充Lyc 干預(yù)后，這種損傷能夠得到很大程度上的改善，表現(xiàn)為EPCs增殖活力的增加，細(xì)胞劃痕愈合率增加，小管平均長(zhǎng)度的增加，進(jìn)一步的研究提示這種功能保護(hù)作用可能與Lyc 激活A(yù)MPK-mTOR-自噬通路有關(guān)，在我們加入AMPK 磷酸化激活的阻斷劑CC 后進(jìn)一步驗(yàn)證AMPK 磷酸化激活是Lyc 發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵信號(hào)分子，而AMPK 磷酸化介導(dǎo)的自噬是Lyc 發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵通路。EPCs 功能障礙在ox-LDL 誘導(dǎo)的AS發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，大量研究應(yīng)用于尋找改善EPCs功能的解決方案［24］?？寡姿帯⒖垢哐獕核幰约把a(bǔ)充維生素D都被認(rèn)為是治療策略［25］。最近越來(lái)越多的研究注目于天然藥物及其單體化合物，如丹參酮ⅡA、柴胡皂苷A 以及淫羊藿苷等均被報(bào)道改善內(nèi)皮功能［26-27］。Lyc 是一種四萜類胡蘿卜素，廣泛存在紅色水果中，Lyc 特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)（11 個(gè)共軛雙鍵）決定了其具有猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等多種生理功能活性［28］，因而被認(rèn)為有光明的應(yīng)用前景。在既往研究中已經(jīng)報(bào)道過(guò)Lyc 對(duì)高糖誘導(dǎo)的EPCs損傷具有保護(hù)作用［29］，在此我們則首次描述了Lyc 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)的EPCs 損傷保護(hù)作用，具體表現(xiàn)為ox-LDL 誘導(dǎo)的EPCs 的增殖、遷移和成管能力的改善，并觀察到Lyc 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)EPCs自噬流的強(qiáng)化。

為了探究Lyc 如何在EPCs 中發(fā)揮其保護(hù)作用，我們測(cè)試了Lyc 在ox-LDL 刺激下對(duì)EPCs 中自噬信號(hào)蛋白表達(dá)的影響。自噬與心血管疾病密切相關(guān)，目前觀察自噬主要通過(guò)透射電鏡直接觀察自噬小體形成來(lái)判斷自噬，或者通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記自噬過(guò)程中的標(biāo)記蛋白。在我們的結(jié)果中顯示100 mg/L ox-LDL可以誘導(dǎo)EPCs自噬，伴有自噬過(guò)程中關(guān)鍵信號(hào)蛋白p62、LC3-Ⅱ、Beclin-1 的表達(dá)差異。但自噬作為“雙刃劍”在ox-LDL 的作用下伴隨著EPCs 分化功能受損，在不利的條件下表現(xiàn)為負(fù)性的調(diào)控作用，而在Lyc 作用下自噬信號(hào)顯著增強(qiáng)反而伴隨著EPCs功能改善，這可能是因?yàn)榭刂谱允尚◇w成熟的機(jī)制是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的，以允許自噬通量適應(yīng)細(xì)胞的需要，并使自噬降解與外部輸入整合，也可能存在與其他程序性死亡信號(hào)串?dāng)_可能。自噬是細(xì)胞程序性死亡方式［2］，對(duì)程序性死亡方式的調(diào)控是恢復(fù)EPCs 功能穩(wěn)態(tài)對(duì)抗AS進(jìn)程的重要方式，既往研究已經(jīng)報(bào)道過(guò)調(diào)控 EPCs 凋亡［2］，自噬［30］改善其功能，而本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道采用Lyc 干預(yù)ox-LDL 誘導(dǎo)的EPCs 呈現(xiàn)自噬活性的增強(qiáng)，且提高了細(xì)胞增殖活力伴細(xì)胞功能的改善，因此，Lyc 的這種保護(hù)作用可能也是通過(guò)經(jīng)典信號(hào)調(diào)節(jié)通路調(diào)控程序性死亡方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)，Lyc 調(diào)控ox-LDL 誘導(dǎo)的EPCs 自噬以維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)是防治AS的一種可行方法。既往研究表明，自噬過(guò)程受 mTOR 和 AMPK［31］兩個(gè)傳感器嚴(yán)格調(diào)節(jié)，AMPK-mTOR-自噬信號(hào)軸的反饋回路保證了適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)機(jī)制。在本次實(shí)驗(yàn)中，ox-LDL 誘導(dǎo)的EPCs 自噬伴隨AMPK 磷酸化活性增加并抑制mTOR 磷酸化，而予以Lyc干預(yù)后則表現(xiàn)p-AMPK表達(dá)進(jìn)一步增高，p-mTOR 表達(dá)水平進(jìn)一步降低，值得注意的是EPCs僅在Lyc的作用下同樣伴隨AMPK磷酸化活性增加，加入CC 后逆轉(zhuǎn)自噬強(qiáng)化且伴有EPCs 功能損傷，我們的研究結(jié)果和前人的研究均確認(rèn)Lyc 為AMPK的激活劑［17，32］，可以直接激活或強(qiáng)化自噬信號(hào)。

總之，Lyc可以有效保護(hù)EPCs的增殖、遷移和成管功能，上調(diào)細(xì)胞的自噬水平，作用機(jī)制可能是通過(guò)AMPK 磷酸化激活有關(guān)，此為L(zhǎng)yc 抗AS 的機(jī)制提供了新的思路。