微射流處理麥醇溶蛋白-蘆丁復(fù)合物的拉曼光譜分析

李春翼，王啟明，雷小娟，趙吉春，雷琳，明建,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學 食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

小麥是世界上最主要的糧食作物之一，富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和其他營養(yǎng)物質(zhì)。小麥醇溶蛋白(gliadin，G)通常被認為是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)，表面含有疏水和親水結(jié)構(gòu)域[1]。先前的研究結(jié)果表明，醇溶蛋白可以通過超聲自組裝和反溶劑沉淀轉(zhuǎn)化為球形膠體納米粒子[2]。在食品工業(yè)中，麥醇溶蛋白納米粒子已被開發(fā)用于微量營養(yǎng)素傳遞體系，該體系易受環(huán)境變化的影響(如溫度[2]，溶劑[2]等)。這些變化可能導致在加工和貯存過程中遞送的生物活性化合物的降解。多酚可以通過非共價相互作用(疏水效應(yīng)和氫鍵)與蛋白質(zhì)相互作用，這可能導致蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、溶解度和消化率的變化[3]。目前，大多數(shù)研究聚焦于水溶性蛋白質(zhì)與酚類化合物之間的相互作用，如牛血清白蛋白和氰基-3-葡萄糖苷[4]，關(guān)于黃酮類化合物與醇溶性蛋白質(zhì)之間的相互作用研究較少。蘆丁(rutin，R)是植物和多酚類化合物的次生代謝產(chǎn)物，被認為是由槲皮素和二糖蘆丁糖(鼠李糖和葡萄糖)組成的糖苷。蘆丁在蕎麥中含量豐富，其結(jié)構(gòu)與槲皮素相似，因此對蛋白質(zhì)具有很強的親和力[5]。研究表明高濃度蘆丁可防止肌原纖維蛋白側(cè)鏈基團的氧化[6]。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)在提取、制備、加工和貯存過程中對涉及到的環(huán)境條件敏感，可能引起蛋白質(zhì)的展開，聚集和變性。

動態(tài)高壓微流化(dynamic high-pressure microfluidization, DHPM)作為最先進的均質(zhì)化技術(shù)之一，有連續(xù)操作條件下高速沖擊、高頻振動、空化和剪切的聯(lián)合處理機制。目前，DHPM已應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品工業(yè)和牛奶加工，賦予其較長的保質(zhì)期[7]。已有研究表明DHPM處理大豆蛋白后，增加了大豆蛋白中某些亞基(α′-7S、A-11S和B-11S)對胰酶水解的可及性，蛋白質(zhì)溶解度、表面疏水性和分子質(zhì)量分布發(fā)生變化，乳化性能提高[8]。

在現(xiàn)有的光譜方法中，傅里葉紅外變換光譜和拉曼光譜都可以確定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化(酰胺Ⅰ和Ⅲ條帶的分析)。但拉曼光譜也提供了肽骨架、二硫鍵的幾何形狀，以及某些側(cè)鏈的環(huán)境，如酪氨酸、色氨酸和蛋氨酸。拉曼光譜學是一種新興且強大的光學技術(shù)，它已被廣泛用于識別分子結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的定性和定量分析[9]。拉曼帶的變化通常與酰胺構(gòu)象區(qū)域的改變和C—C拉伸振動有關(guān)。事實上，在DHPM過程中形成的蛋白網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性可歸因于非共價或疏水鍵，以及分子間和分子內(nèi)的二硫化物鍵。

因此，本文采用反溶劑法制備了麥醇溶蛋白-蘆丁(gliadin-rutin,G-R)復(fù)合物，以麥醇溶蛋白為對照，旨在探討DHPM對G-R復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥醇溶蛋白，美國Sigma公司；蘆丁，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津公司；LGJ-10真空冷凍干燥機，北京松原華興科技有限公司；M-110EH-30超微流動態(tài)高壓納米分散機，加拿大Microfluidics公司；MiLLi-Qbiocel超純水機，美國密理博公司；DXR2激光拉曼光譜儀，美國Thermo Fisher公司；85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復(fù)合物的制備

采用反溶劑法制備G-R分散液，參考FILIPPIDI等[10]的方法略作修改。在磁力攪拌下將0.1 g麥醇溶蛋白和0.01 g蘆丁分別溶解于50 mL 10 mmol/L乙酸溶液和50 mL 60%(體積分數(shù))乙醇水溶液中，在4 ℃下貯存過夜以完全水合然后等體積混勻。水相體積:醇相體積比為3∶1。將100 mL G-R溶液逐滴滴入300 mL水溶液中，邊滴邊均質(zhì)(10 000 r/min, 4 min)。均質(zhì)完成后，所得溶液在0、40、80、120、160 MPa下均質(zhì)2次。經(jīng)上述步驟后的樣液一部分留樣用作部分指標測定，另一部分于45 ℃水浴下旋蒸后凍干進行固體樣測定。在沒有蘆丁添加的情況下相同條件制備麥醇溶蛋白溶液。

1.3.2 游離巰基含量變化測定

參照WU等[11]的研究方法做適當修改。在1 mL蛋白質(zhì)溶液中加入4 mL Tris-Gly緩沖液。之后，加入0.05 mL Ellman試劑，Ellman試劑配制方法為：將溶于水中的2 mmol/L 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid, DTNB)和50 mmol/L乙酸鈉混合。最后將混合溶液在室溫下孵育20 min，然后在412 nm處測量吸光度。游離巰基(sulfhydryl，SH)含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A代表吸光度；D代表稀釋倍數(shù)；C代表樣品濃度，mg/mL。

1.3.3 拉曼光譜測定

將凍干后的樣品置于玻璃載玻片上，用激光拉曼顯微鏡在785 nm的激發(fā)波長下進行實驗。實驗參數(shù)為：顯微鏡物鏡為20倍，光斑尺寸為1 μm，狹縫寬度為50 μm，激光能量為15 mW，背景曝光時間為4.2 s，曝光次數(shù)為38，背景曝光次數(shù)為512，光柵400刻度/nm，掃描范圍為500～4 000 cm-1。使用OMNIC 8.2(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)軟件進行光譜基線校正，平滑和原始數(shù)據(jù)歸一化處理[以苯丙氨酸(1 003 cm-1)為內(nèi)標進行歸一化處理]。分析二級結(jié)構(gòu)變化、二硫鍵的構(gòu)象(500～550 cm-1)以及酪氨酸(I850/830)和色氨酸(I760)的環(huán)境。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每組數(shù)據(jù)3次重復(fù)，利用Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)與作圖。使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA差異顯著性分析與t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離巰基含量

巰基含量的變化是蛋白質(zhì)去折疊和S—S鍵形成的標志，也與蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)[12]。本研究測定的巰基含量[(22.69±0.55) μmol/g]比王啟明[13]的研究結(jié)果[(13.24±0.00) μmol/g]相似，這些數(shù)據(jù)的差異可以歸因于不同的蛋白質(zhì)來源與研究方法的差異。如圖1所示，隨著處理壓力的增加，活性巰基含量顯著增加，這可能是由于在高壓處理過程中蛋白質(zhì)分子的去折疊,QIN等[14]也報道了類似的結(jié)果。高壓處理引發(fā)了內(nèi)部疏水基團和巰基的暴露，增強了表面疏水性和二硫鍵的形成，因此這些蛋白質(zhì)很有可能被吸附到油滴表面。這些相互作用可能提供一種高黏彈性薄膜，以抵抗聚結(jié)，從而提高空間穩(wěn)定性，防止油滴的絮凝和聚結(jié)。各微射流處理組可能被蘆丁作為抗氧化劑保護，因此其游離巰基含量增加。以上結(jié)果表明微射流對麥醇溶蛋白中游離巰基的作用受微射流壓力的影響。

圖1 微射流處理后麥醇溶蛋白與蘆丁復(fù)合物的游離巰基含量Fig.1 Free sulfhydryl content of the complex of gliadin and rutin after DHPM treatment注：圖中不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)

2.2 氨基酸微環(huán)境分析

圖2為400～1 700 cm-1的拉曼光譜。氨基酸側(cè)鏈芳香族基團在拉曼光譜中具有特征條帶。這些條帶可以用來測量氨基酸所在的微環(huán)境的極性及其參與氫鍵的程度[15]。在830 cm-1和850 cm-1處觀察到的拉曼光譜峰對應(yīng)于蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基中對位取代苯基的振動，這與酚羥基之間形成的氫鍵相互作用有關(guān)，830 cm-1和850 cm-1處2個峰的拉曼強度比值(I850/I830)稱為費米共振[16]。費米共振的值表明酪氨酸殘基在微環(huán)境中嵌入或暴露的程度。I850/I830值的減少，表明酪氨酸殘基埋藏在蛋白質(zhì)中并參與氨基酸間分子內(nèi)和分子間氫鍵的形成。該值的增加表明酪氨酸殘基暴露于水相或極性微環(huán)境[17]。利用760 cm-1附近的拉曼帶的歸一化強度來測量色氨酸殘基的疏水性并反映蛋白質(zhì)的疏水相互作用[18]。表1列出了麥醇溶蛋白的幾個殘基的歸一化強度。

表1 高壓微射流處理后麥醇溶蛋白與蘆丁復(fù)合物的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、脂肪族氨基酸)微環(huán)境分析Table 1 Side chain group band strength of gliadin and rutin after DHPM treatment

a-麥醇溶蛋白-蘆丁復(fù)合物;b-麥醇溶蛋白圖2 微射流處理后麥醇溶蛋白與蘆丁復(fù)合物的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of the complex of gliadin and rutin after DHPM treatment

2.2.1 酪氨酸殘基

酪氨酸雙峰帶比率(I850/830)被認為是反映酚羥基氫鍵的指標。該比率表示酪氨酸側(cè)鏈是埋藏還是暴露在蛋白質(zhì)表面。當I850/830>1.0時，酪氨酸殘基暴露在水中，能夠參與中度或較弱的氫鍵。相反，低比率表明酪氨酸殘基被埋在疏水環(huán)境中，并傾向于作為氫鍵供體來增強內(nèi)部氫鍵[18]。I850/830的降低反映了酪氨酸殘基埋葬的增加，這表明酪氨酸殘基參與了分子間或分子內(nèi)的相互作用，或相互作用增強。當酪氨酸殘基暴露時，850 cm-1帶比830 cm-1帶更強烈。與此同時，I850/830在相同的160 MPa壓力下呈上升趨勢，這也表明高壓力條件下酪氨酸殘基更容易暴露于水中，暴露的酪氨酸殘基可能有助于蛋白質(zhì)的靜電相互作用[15]。

2.2.2 色氨酸殘基

如表1所示，與未處理組相比，當微射流處理后，麥醇溶蛋白的I760不同程度地增加，當壓力達80 MPa時，光譜強度開始有所下降，先前嵌入的色氨酸殘基在較高的壓力條件下重新暴露，但由于疏水效應(yīng)更強，進一步強制暴露很困難[15]。當微射流壓力達到160 MPa時，強度增加最為明顯，從0.32增加到0.54。與蘆丁形成復(fù)合物后，I760增加至0.35。這些數(shù)據(jù)表明，在DHPM和蘆丁的作用下，麥醇溶蛋白的色氨酸微環(huán)境殘基趨于掩埋，而DHPM處理后的G-R的I760同樣表現(xiàn)出不同程度的增加，在微射流壓力為40、80、120、160 MPa時，分別增加至0.54、0.55、0.63、0.83，表明色氨酸殘基進一步嵌入在疏水微環(huán)境中[19]。

2.3 C—H、—CH2、—CH3彎曲振動變化

1 450 cm-1處的拉曼光譜帶主要是由脂肪族殘基C—H、—CH2和—CH3的彎曲振動形成的。疏水基團暴露于極性環(huán)境中，導致脂肪族殘基在1 450 cm-1處的彎曲帶強度增加[20]。在1 450 cm-1時，強度的降低可能表明脂肪族氨基酸殘基又埋藏在分子內(nèi)部。表1顯示了G處理組與G-R處理組在1 450 cm-1時的拉曼光譜強度。在相同的處理壓力下，微射流處理的G-R組拉曼光譜強度明顯高于微射流處理的G組，這是由于蘆丁的加入引起的脂肪族殘基通過氫鍵產(chǎn)生的內(nèi)部交聯(lián)減弱[15]。在不同的微射流壓力處理情況下，G與G-R組在1 450 cm-1處的光譜強度從顯著增加(P>0.05)，光譜強度分別從1.02、1.79顯著增加到2.00、6.13。由此可知，微射流處理促進了脂肪族殘基暴露于極性環(huán)境中[21]。G-R處理組在1 450 cm-1處的光譜強度隨著壓力的增加而顯著增加，說明蘆丁和一定的壓力處理對麥醇溶蛋白的脂肪族殘基均有影響，且具有協(xié)同作用。

2.4 二級結(jié)構(gòu)分析

拉曼帶的頻率和強度反映了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲)和蛋白的局部環(huán)境的變化[22]。光譜的峰和位置都有不同程度的變化，表明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水之間的氫鍵發(fā)生了變化[18]。一般來說，酰胺I帶中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的特征條帶分別位于1 645～1 660 cm-1(α-螺旋)、1 670～1 680 cm-1(β-折疊)、1 640～1 645 cm-1；1 680～1 690 cm-1(β-轉(zhuǎn)角)和1 660～1 665 cm-1(無規(guī)則卷曲)處[23-24]。如圖3所示，在微射流壓力為40、80、120、160 MPa時，麥醇溶蛋白的α-螺旋含量相較于未經(jīng)微射流處理分別減低了6.93%，9.38%，6.58%，5.39%。而β-折疊含量的變化趨勢與之相反，從 27.71%分別增加至28.42%，28.56%，28.73%，28.83%。β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲含量也呈現(xiàn)了不同程度的增加趨勢。這些結(jié)果表明，微射流通過減少α-螺旋，增加β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量來修飾麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)。這些修飾與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)，表明構(gòu)象的變化導致了一個更無序的結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。更具體地說，DHPM通過破壞內(nèi)部氫鍵展開α-螺旋，誘導β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的形成，導致二級結(jié)構(gòu)的改變，并導致水和蛋白質(zhì)之間的牢固結(jié)合。與相同壓力下的麥醇溶蛋白組相比，DHPM處理的G-R組具有更高的α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角以及更少的β-折疊、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是，蘆丁確實影響了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。DHMP條件下，G-R組的α-螺旋、無規(guī)則卷曲含量減少，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量增加。

a-麥醇溶蛋白；b-麥醇溶蛋白-蘆丁復(fù)合物圖3 不同微射流條件下麥醇溶蛋白與蘆丁復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Secondary structure of gliadin-rutin complex under DHPM conditions

2.5 二硫鍵構(gòu)象

在共價鍵和非共價鍵中，二硫鍵(S—S)在蛋白結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵作用，或在蛋白質(zhì)內(nèi)形成分子內(nèi)二硫鍵，或在蛋白質(zhì)鏈之間形成分子間二硫鍵[25]。二硫鍵在分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中起著不可或缺的作用。一般在文獻中，二硫化物條帶幾乎完全基于500～550 cm-1的頻率值。這些頻率值之間的差異通常歸因于二面角Cα-Cβ-S—S′-Cβ′-Cα′的構(gòu)象不同。二硫鍵的條帶可大致分為3個構(gòu)象區(qū)域，分別為gauche-gauche-gauche(g-g-g)(500～510 cm-1)、gauche-gauche-trans(g-g-t)(515～525 cm-1)和trans- gauche-trans(t-g-t)(535～545 cm-1)。通過曲線擬合獲得的定量數(shù)據(jù)(圖4)可知，麥醇溶蛋白的主要二硫鍵構(gòu)象為g-g-g(44.66%)，與王啟明[13]的研究結(jié)果一致。g-g-g構(gòu)象被認為比其他2種構(gòu)象更穩(wěn)定，其與497 cm-1左右的帶之間存在區(qū)別。g-g-g屬于分子間的S—S鍵，帶位于514 cm-1左右。g-g-t和g-g-g構(gòu)象分別與鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵相關(guān)。隨著DHPM處理壓力的增加，g-g-t和 t-g-t構(gòu)象含量增加，但g-g-g構(gòu)象含量降低，這表明DHPM可以破壞鏈間二硫鍵，t-g-t構(gòu)象含量增加表明麥醇溶蛋白分子間作用力增強，進而形成一種趨于更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。荷載蘆丁后，g-g-g和t-g-t構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)間-g-t構(gòu)象，這表明蘆丁在二硫橋的構(gòu)象中起重要作用。蘆丁的加入似乎阻止了二硫化合物分子間S—S鏈的形成，相反，有利于被認為不太穩(wěn)定的g-g-t構(gòu)象的增加。王啟明[13]用槲皮素修飾麥醇溶蛋白也觀察到了類似的現(xiàn)象。由此可以得出結(jié)論，DHPM與蘆丁決定著蛋白微環(huán)境和構(gòu)象的顯著變化。

a-麥醇溶蛋白；b-麥醇溶蛋白-蘆丁復(fù)合物圖4 不同微射流條件下麥醇溶蛋白與蘆丁復(fù)合物的二硫鍵構(gòu)象圖Fig.4 Disulfide bond conformation of gliadin-rutin complex under DHPM conditions

3 結(jié)論

本研究是首次探究DHPM引起的麥醇溶蛋白-蘆丁復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化，并直接用拉曼光譜分析的研究。在不同的DHPM階段可以觀察到特定的行為。拉曼光譜研究證實，DHPM處理后的G-R，其分子間g-g-g二硫鍵構(gòu)象明顯增加，與β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的增加以及色氨酸和酪氨酸殘基的疏水埋藏有關(guān)。這些變化意味著一個更有序的結(jié)構(gòu)，有利于麥醇溶蛋白-蘆丁復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。事實上，微射流處理的樣品組t-g-t含量增加，分子間作用力增強。蘆丁的添加似乎減少了分子間g-g-g構(gòu)象、β-折疊結(jié)構(gòu)的形成，而不改變氫鍵。因此，分子間二硫鍵構(gòu)象在蛋白多酚復(fù)合過程中的結(jié)構(gòu)演化和麥醇溶蛋白網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性方面起著決定性的作用。需要進一步研究以確定二硫鍵構(gòu)象的變化是所觀察到的二級蛋白結(jié)構(gòu)變化的原因或影響因素。