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    魚骨膠原蛋白提取、純化工藝及應(yīng)用的研究進(jìn)展

    2022-12-29 13:10:30宮萱包建強(qiáng)黃可承陳彥婕唐嘉誠
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年24期
    關(guān)鍵詞:中性鹽魚骨膠原蛋白

    宮萱,包建強(qiáng),黃可承,陳彥婕,唐嘉誠

    (上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)

    我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)、加工及消費大國,近些年來,水產(chǎn)品產(chǎn)量和需求不斷增加,2020年我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量約達(dá)6 545萬t,占世界總產(chǎn)量的3/5以上,預(yù)計2029年將達(dá)到7 232萬t,但近些年來,我國水產(chǎn)品加工企業(yè)數(shù)量呈下降趨勢[1]。魚體在加工過程中超鮮重的50%都會被當(dāng)作下腳料,按50%計算[2],2020年就產(chǎn)生了約3 272.52萬t下腳料,在這當(dāng)中有近25%為魚骨。大部分的魚骨都被當(dāng)做加工廢料直接丟棄,僅有少部分被加工成動物飼料,事實上,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),魚骨中蛋白質(zhì)、必需氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富,如果能被合理加工利用,不僅能夠減少垃圾處理費用,增加加工附加值,為行業(yè)帶來巨大利益,還能節(jié)約寶貴的魚類資源,減少對環(huán)境的污染。

    膠原蛋白又常稱膠原,主要存在于自然界的動物結(jié)締組織中,常以膠原纖維的形式廣泛存在于動物的皮、骨、軟骨、肌鍵、肌膜和韌帶等組織中。經(jīng)近些年研究發(fā)現(xiàn),膠原蛋白具有獨特的理化特性,自被提取出以來,廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域,具有防止骨質(zhì)疏松[3]、美容抗衰[4]、抗?jié)僛5]、治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[6]、調(diào)控內(nèi)分泌[7]、促進(jìn)傷口愈合[8]等生理功能。由于口蹄疫、傳染性海綿狀腦病和牛海綿狀腦病等各種疾病的爆發(fā),水源膠原蛋白逐漸替代陸生源膠原蛋白的市場占有,與陸地動物相比,水源膠原蛋白具有膠原蛋白含量高、疾病傳播風(fēng)險小、沒有宗教和倫理沖突、炎癥反應(yīng)低等優(yōu)點。從加工下腳料——魚骨中提取膠原蛋白,不僅能夠充分利用魚類資源,改善環(huán)境污染嚴(yán)重問題,還為提取膠原蛋白提供了新的材料。本文對魚骨中膠原蛋白的提取、純化及其應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)綜述,介紹其研究現(xiàn)狀,并對未來發(fā)展進(jìn)行思考與展望,為該領(lǐng)域的學(xué)者提供參考。

    1 魚骨膠原蛋白的提取

    在今天,魚骨經(jīng)常以低價出售給飼料廠生產(chǎn)骨粉[9],僅有少部分零售或加工成即食零食出售,而這些零食的生產(chǎn)人工、設(shè)備費用遠(yuǎn)高于材料本身。魚骨中的膠原蛋白主要為I型,含有多種人體必需氨基酸,是一種良好的提取膠原蛋白的原料。魚骨作為加工副產(chǎn)物,其表面往往含有許多色素、礦物質(zhì)、非膠原蛋白和脂肪等物質(zhì),故在加工前要先進(jìn)行預(yù)處理。礦物質(zhì)常使用無機(jī)材料如乙二胺四乙酸溶液去除,脂肪和色素等常使用氯化鈉、正丁醇等有機(jī)溶劑去除[10],預(yù)處理的主要目的是去除雜質(zhì)以提高膠原蛋白的質(zhì)量。由于膠原蛋白具有難溶于水、微溶于有機(jī)溶劑的特點[11],所以需根據(jù)不同種類、用途、條件組合破壞膠原蛋白分子間共價交聯(lián)作用力,根據(jù)這些方法,膠原蛋白可分為酸溶性或堿溶性膠原蛋白(alkali soluble collagen,ASC)、中性鹽溶性膠原蛋白(salt-soluble collagen,SSC)、超聲輔助膠原蛋白(ultrasound assisted collagen,UAC)和酶溶性膠原蛋白(pepsin-soluble collagen,PSC)[12]。表1列出從不同魚骨中提取膠原蛋白的條件及提取率。

    表1 不同魚類骨骼中膠原蛋白的提取率Table 1 Rate of collagen extraction in different animal bones

    1.1 酸法或堿法提取膠原蛋白

    酸法或堿法提取膠原蛋白的原理是加入一定濃度的酸堿溶液,破壞膠原蛋白分子間的共價交聯(lián)作用力,使肽鍵水解,膠原分子溶解。酸法提取常用的酸性介質(zhì)為醋酸、冰乙酸、檸檬酸、鹽酸、甲酸、乳酸等。堿法常用的堿性介質(zhì)為氫氧化鈉、石灰等。酸法提取膠原蛋白的優(yōu)勢在于能夠最大程度保留其原本的三螺旋結(jié)構(gòu)[17],且提取率更高,得到的產(chǎn)物可用于化妝品、制藥和制作一些具有不同功能特性的明膠。而利用堿法提取膠原蛋白得率遠(yuǎn)低于酸法,且產(chǎn)物結(jié)構(gòu)易發(fā)生變異,分子量較低,局限性較大,所以堿法現(xiàn)如今很少單獨使用,常與酸法進(jìn)行結(jié)合使用。吳緹等[26]在相同條件下,分別采用檸檬酸與乙酸兩種酸液提取斑點叉尾鮰魚骨中膠原蛋白,結(jié)果表明,檸檬酸的提取率比乙酸高出0.14倍,同時檸檬酸具有無色無味的特點,更加適合應(yīng)用于食品、醫(yī)療美容等行業(yè)。不同種類的魚骨酸提取條件不同,實驗過程中往往通過調(diào)節(jié)提取時間、溫度和酸堿液濃度等變量最大化地提取魚骨中的膠原蛋白。NAGAI等[27]以多種魚混合廢料中的魚骨為原料,利用醋酸提取其中膠原蛋白,發(fā)現(xiàn)樣品中含有大量的膠原蛋白(40%~53%),是非常好的膠原蛋白潛在來源。

    1.2 中性鹽法提取膠原蛋白

    中性鹽提取膠原蛋白的原理是利用中性鹽提取魚骨中鹽溶性膠原蛋白,常用的中性鹽介質(zhì)有氯化鈉、磷酸鹽、檸檬酸鹽等,通過選擇不同種類的鹽溶液、提取溫度和溶液濃度來提高膠原蛋白提取率。中性鹽法提取法具有膠原蛋白在鹽溶液中溶解度較低、提取過程中穩(wěn)定性較差等缺點。WANG等[24]采用了酶法、酸法、中性鹽法、提取史氏鱘中軟骨的膠原蛋白,對比3種方法的提取率分別為55.92%、27.04%、2.18%,可以看出利用酶法的提取率是中性鹽法的近28倍,因此該技術(shù)已被限制用于膠原蛋白提取。

    1.3 酶法提取膠原蛋白

    酶法提取膠原蛋白的原理是酶作用于膠原中的大分子蛋白,使膠原蛋白末端肽鏈間的賴氨酸或羥賴氨酸相互作用形成的共價鍵斷裂。酶法提取具有不容易破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu),作用條件溫和,操作簡單,無污染,提取率高,理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點,因此酶法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于膠原蛋白提取工業(yè),常用的酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和不同的膠原酶等。陳申如等[28]分別利用豬胰蛋白酶和蛋白酶K提取鯊魚、鰱魚、草魚、羅非魚4種魚魚骨中的膠原蛋白并對酶解結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)4種魚骨均可被酶水解,且水解產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)與魚的品種有關(guān),魚品種差異越大,結(jié)構(gòu)差異也越大。LI等[29]比較了從西班牙鯖魚骨中提取的ASC和PSC,發(fā)現(xiàn)PSC產(chǎn)量要略高于ASC,說明胃蛋白酶可以消化水解膠原端肽區(qū)域的交聯(lián)分子,提高水解效率,YU等[30]提取并比較了來自鰹魚頭骨和脊柱的ASC和PSC,發(fā)現(xiàn)利用胃蛋白酶消化可以令膠原蛋白產(chǎn)量提高1.88~2.28倍。

    1.4 超聲波輔助提取

    超聲波輔助提取是近年來新興的提取方式,超聲波是一種無污染、環(huán)保、操作簡便、反應(yīng)速度快且經(jīng)濟(jì)實惠的技術(shù),其輔助提取膠原蛋白的機(jī)理為利用超聲空化作用產(chǎn)生的巨大壓力,使未交聯(lián)的膠原分子瞬間分離,而后超聲的機(jī)械效應(yīng)能夠促使分離,提高膠原蛋白提取率,同時超聲處理,能夠打開膠原纖維,從而促進(jìn)酸和酶處理,與傳統(tǒng)方法相比能夠顯著縮短提取時間。在利用超聲波輔助提取的過程中,原料所含I型膠原蛋白含量、超聲波時間、單位面積的超聲的不同,都會影響提取率的高低,因此工業(yè)上往往應(yīng)用低頻大功率的超聲波輔助提取膠原蛋白。嚴(yán)秋萍等[15]利用超聲輔助提取齊口裂腹魚骨中膠原蛋白,膠原蛋白得率可達(dá)6.91%,得到的產(chǎn)物完整性較好且純度較高,但仍具有提取時間較長的問題。

    2 魚骨膠原蛋白的純化

    膠原蛋白自魚骨中提取出來后,仍會存在雜質(zhì)、提取過程中使用的剩余溶劑、小分子蛋白肽等物質(zhì),致使膠原蛋白的純度低,需要進(jìn)一步純化產(chǎn)物,得到可利用和分析的高純度膠原蛋白。膠原蛋白的純化目前的方法有鹽析、透析、層析、色譜、電泳等,最常使用的方法為鹽析與透析相結(jié)合,這個過程往往需要反復(fù)多次,純化周期從1周~數(shù)周不等。近些年來,相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者不斷探尋新方法,研究出多種復(fù)合材料組成的超濾膜來分離純化蛋白,在縮短純化周期和提高純化效率方面有了顯著提升,但目前技術(shù)尚未成熟且成本較高,膠原蛋白純化技術(shù)仍需繼續(xù)研究發(fā)展。下列舉出3種傳統(tǒng)的和近些年新興的膠原蛋白純化方法。

    2.1 鹽析法

    鹽析法純化膠原蛋白往往與透析組合使用,通常需要反復(fù)多次才可達(dá)到純化目的,AHMED等[31]從大眼金槍魚副產(chǎn)品中提取ASC和PSC過程中,不斷加入NaCl至溶液終濃度為2 mol/L,離心收集沉淀后溶于乙酸,ASC需要用0.1 mol/L乙酸透析24 h,后透析液換為蒸餾水再透析48 h。為了終止胃蛋白酶反應(yīng)得到出純度較高的PSC,需要將上清液置于0.02 mol/L Na2HPO4溶液中(pH 7.2、分子質(zhì)量為30 kDa)透析24 h。CUMMING等[32]為了得到純度較高的硬骨魚軟骨膠原蛋白,采用差鹽沉淀法去除蛋白聚糖,可以保持分子的主要膠原核心僅被特定的酶切割,同時通過調(diào)節(jié)加入的NaCl濃度來提取不同種類的膠原蛋白[33]。但這種方法只允許部分膠原蛋白種類,純化后得到的沉淀物總是被污染,必須經(jīng)過后續(xù)的步驟中使用如色譜法等技術(shù)處理[34]。由此可見,常用的鹽析和透析組合方法具有工藝復(fù)雜、周期長、膠原蛋白易污染等缺點,難以滿足工業(yè)需求。

    2.2 層析法

    層析法又稱色譜法,是眾多蛋白純化方法中針對性最強(qiáng)的一種方法,它的機(jī)制是利用目的蛋白與特定分子間的特異性識別和其性質(zhì)的差異進(jìn)行分離,該種方法具有高度的專一性、效率高、操作簡單、成本相對較低等優(yōu)點。劉磊[35]利用陽離子層析法純化海蜇膠原蛋白,選用NaCl作為洗脫液,對得到的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明,得到的I型膠原蛋白在經(jīng)過離子交換后純度大大提高。MIURA等[36]則選用CM-纖維素色譜法進(jìn)行純化,將得到的水母膠原蛋白粗品應(yīng)用于羧甲基-纖維素柱,并以0~0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫,探究純化后的蛋白發(fā)現(xiàn),羧甲基-纖維素能夠成功地分離水母膠原蛋白中的α鏈,其結(jié)構(gòu)類似于脊椎動物中的V型膠原蛋白。

    2.3 超濾法

    超濾法早些年就用于蛋白質(zhì)的脫鹽、分離以及濃縮步驟,但關(guān)于純化膠原蛋白的報道并不多,其原理主要是利用滲透壓所產(chǎn)生的壓力,在膜內(nèi)外分離不同尺寸的粒子。陳思謹(jǐn)[37]選用聚醚砜作為超濾膜材料,對魚鱗中的ASC與PSC進(jìn)行超濾分離,超濾前對超濾膜及其設(shè)備進(jìn)行放大處理,可一次性處理15 L膠原蛋白處理液,大大解決了鹽析法處理量小,無法滿足工業(yè)需求的弊端。張雄等[38]同樣利用超濾技術(shù)去除酸處理后樣液中殘留的大量鹽離子,將樣液加入到裝備有聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜的超濾杯中,不斷加入蒸餾水進(jìn)行洗滌,達(dá)到脫鹽的目的。結(jié)果表明,膠原溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%時截留效果最好,且在過程中施加的壓力越大,操作溫度在30 ℃范圍內(nèi)越高,脫鹽效果越好,最高可達(dá)74.4%。

    3 魚骨膠原蛋白的應(yīng)用

    3.1 在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

    膠原蛋白中富含多種人體所需營養(yǎng)物質(zhì),特別是鈣、磷等微量元素,易于被人體吸收利用。趙玉紅等[39]在生產(chǎn)的運動飲料中加入鰱魚副產(chǎn)物中水解的膠原蛋白,能夠同時為運動員補(bǔ)充充足的蛋白質(zhì)和水分,并顯著改善產(chǎn)品功能特性。膠原蛋白作為一種天然的高分子化合物,可以作為食品添加劑被添加到食品中作為乳化劑、澄清劑、增稠劑等[40]。DUAN等[41]提取鯉魚鱗中的膠原蛋白,針對其生物活性特點,將膠原蛋白摻入水牛奶中開發(fā)了一種乳基食品——奶酪。發(fā)現(xiàn)加入膠原蛋白的合成奶豆腐具有良好的質(zhì)地和感官屬性,且增加了牛奶的蛋白質(zhì)含量。膠原蛋白也可用來食品保鮮,膠原蛋白和明膠因其成膜能力、生物相容性、抗菌性和良好的氣體阻隔性而被廣泛應(yīng)用,能夠隔絕氧氣與食品接觸,防止水分遷移、脂肪氧化、變色和微生物活動,保證食品良好的感官品質(zhì)和貨架期。甘釗生等[42]利用羅非魚鱗膠原蛋白制作涂膜液保鮮圣女果,結(jié)果表明,膠原蛋白涂膜液能夠有效抑制圣女果發(fā)生褐變,在貯存過程中降低腐爛率,延長圣女果的貯藏期和貨架期,是一種安全、高效且價格低廉的保藏手段。

    3.2 在化工品領(lǐng)域中的應(yīng)用

    膠原蛋白因其具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和特殊的生理活性,也常被廣泛用于動物飼料、醫(yī)療美容、組織工程等行業(yè)。沈徽霞[43]在母羊的飼料中添加一定量的膠原蛋白,形成微囊型酸化劑,制得的飼料不僅能夠滿足母羊的基本營養(yǎng)需求,其酸化成分還能夠在母羊胃中消化吸收,改善腸道菌群平衡,增強(qiáng)免疫力,提高母羊的泌乳量。魚類水解膠原蛋白作為一種營養(yǎng)添加劑,具有安全營養(yǎng)、價格低廉、原料易得等優(yōu)點。SUOSA等[44]從大西洋鱈魚魚鰾中提取酸溶和酶溶性膠原蛋白,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物具有典型的剪切稀化行為,同時在高質(zhì)量濃度(3 mg/mL)產(chǎn)物存在下,對培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞也不具有細(xì)胞毒性行為,為進(jìn)一步將其開發(fā)生物材料提供了有力證明。目前魚骨膠原蛋白在美容、組織工程行業(yè)應(yīng)用較少,主要是人們對其營養(yǎng)成分的認(rèn)識和開發(fā)利用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,仍待進(jìn)一步研究。

    3.3 在醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用

    膠原蛋白具有生物相容性、止血性、可塑性、功能性等特點,在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。外科手術(shù)常使用源自動物膠原蛋白的天然可吸收縫合線,這種縫合線具有較好的抗張強(qiáng)度,操作簡單,便于手術(shù)醫(yī)生打結(jié)縫合,且又具有可吸收性,不會留下明顯的疤痕。在各科手術(shù)中,止血也是一個必不可少的環(huán)節(jié),膠原蛋白同樣是一種良好的止血材料[45],其獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)血小板附著凝結(jié),能夠使創(chuàng)面滲血區(qū)迅速凝結(jié)成血痂,同時也可充當(dāng)敷料,防止術(shù)中或術(shù)后感染,促進(jìn)傷口愈合。膠原蛋白也擬作為人體器官或組織的替代品,在心血管外科領(lǐng)域常被用來制作心臟支架或血管的替代品[46]。在皮膚科,膠原蛋白等高分子化合物為主要材料在臨床上已廣泛應(yīng)用于修復(fù)皮膚損傷創(chuàng)面、人造皮膚、瘢痕攣縮改善、皮膚組織工程等方向[47]。重組后的膠原蛋白材料也可用于角膜移植、隱形眼鏡的制作等,在未來有期望成為高?;颊叩慕悄ぬ娲穂48]。

    4 結(jié)論及展望

    隨著科技的發(fā)展以及國人對健康生活的重視,膠原蛋白行業(yè)近些年來飛速發(fā)展,到2019年,中國天然膠原的產(chǎn)量規(guī)模已經(jīng)達(dá)到2 000 t,占全球產(chǎn)量份額的6.33%,其中醫(yī)療健康模塊占比47%,食品飲料模塊占比32%,化妝品模塊占比13%。研究表明,魚類加工副產(chǎn)物可作為提取膠原蛋白安全且低廉的材料,但現(xiàn)如今仍存在原料前處理復(fù)雜、提取純化過程周期較長、無法滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)需要、消費者認(rèn)可度不高等問題存在,因此探索水源膠原蛋白功能活性,優(yōu)化提取純化工藝流程,縮短生產(chǎn)周期是未來的研究方向。目前,對于水源膠原蛋白生理活性的研究仍處于實驗階段,需要進(jìn)一步研究其長期安全性。隨著技術(shù)不斷更新發(fā)展,會有更多安全、功能多樣、利用率高、價格低廉的水源膠原蛋白及其制品能夠造福人類,為產(chǎn)業(yè)帶來巨大利益,為我國水產(chǎn)品行業(yè)的發(fā)展推波助瀾。

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