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    液相色譜質(zhì)譜對重組人生長激素-Fc(CHO 細(xì)胞)二硫鍵連接的確認(rèn)

    2021-10-20 08:24:50朱秋媚王宇劉涵富瑞麗劉瑩劉景會(huì)顧建陽
    中國生物制品學(xué)雜志 2021年10期
    關(guān)鍵詞:離子流二硫鍵胰酶

    朱秋媚,王宇,劉涵,富瑞麗,劉瑩,劉景會(huì),顧建陽

    長春生物制品研究所有限責(zé)任公司,吉林長春130062

    二硫鍵(S-S 鍵)是通過蛋白質(zhì)中兩個(gè)半胱氨酸上的巰基(-SH)氧化而形成的,在穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象和保持其活性方面起著重要作用[1]。重組人生長激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc 是由兩個(gè)相對分子質(zhì)量為22 125 的GH 與相對分子質(zhì)量為50 280 的重鏈通過Linker 連接而成,重鏈之間通過兩對鏈間二硫鍵形成同源二聚體[2]。抗體藥物中二硫鍵的排布是對其結(jié)構(gòu)特征的一種反映[3],因此,二硫鍵連接的確認(rèn)成為rhGH-Fc 結(jié)構(gòu)確認(rèn)過程中非常重要的一環(huán)。

    液相色譜質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)作為一種分析工具,在蛋白質(zhì)藥物研發(fā)前期的結(jié)構(gòu)表征、工藝優(yōu)化、關(guān)鍵質(zhì)量屬性分析以及質(zhì)量控制中有普遍應(yīng)用[4],LC-MS 能夠精確測定多肽及蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量,且通過二級碎片信息可解析肽段的氨基酸序列[5],特別是蛋白質(zhì)藥物的二硫鍵確認(rèn)和翻譯后修飾分析,質(zhì)譜的作用不可或缺[6]?;谫|(zhì)譜技術(shù)的分析方法能應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)的各個(gè)階段,提供蛋白質(zhì)藥物的一級序列信息(包括翻譯后修飾)、高級結(jié)構(gòu)分析以及構(gòu)象研究等[7-8]。因此,本研究采用LC-MS 建立特異的方法,對rhGH-Fc 的二硫鍵進(jìn)行解析。

    1 材料與方法

    1.1 樣品 rhGH-Fc 為本公司制備。

    1.2 主要試劑及儀器 鹽酸胍購自美國Gibco 公司;碘乙酰胺(iodoacetamide,IAM)購自美國 Sigma公司;胰酶購自美國Promega 公司;乙腈(LC-MS 級)購自美國Honeywell 公司;甲酸(LC-MS 級)購自美國Fisher 公司;碳酸氫銨(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超濾管購自美國Millipore 公司;AcQuity 液相色譜系統(tǒng)、色譜柱CSHC1(82.1 mm ×100 mm,130 ?,1.7 μm)、G2-XS 精確質(zhì)量四級桿飛行時(shí)間(Q-TOF)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和UNIFI 軟件購自美國Waters 公司。

    1.3 樣品的制備 取 200 μL 樣品,加入 600 μL 鹽酸胍(8 mol / L),50 ℃水浴 0.5 h;取出放至室溫,加入8 μL 碘乙酰胺(1 mol / L),避光 30 min;取上述樣品加入超濾管中,13 201 × g 離心5 min,棄去濾過液,加入50 mmol / L NH4CO(3pH 8.0)緩沖液置換,離心操作10 次,最后用50 mmol / L NH4CO(3pH 8.0)緩沖液將蛋白濃度調(diào)節(jié)至0.3 mg / mL。分別按胰酶 ∶蛋白 1 ∶15 的比例加入胰酶,37 ℃酶解4 h。

    1.4 液相色譜條件 色譜柱:CSHC1(82.1 mm×100 mm,130 ?,1.7 μm);流動(dòng)相 A:100%水(含 0.1%甲酸);流動(dòng)相B:100%乙腈(含0.1%甲酸);流速:0.3 mL/min;柱溫:65 ℃;上樣量:5 μL;梯度洗脫表見表 1。

    表1 液相梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution in LC

    1.5 質(zhì)譜條件 MSE采集模式;毛細(xì)管電壓:2 500 V;Cone 電壓:40 V;去溶劑氣體溫度:350 ℃;源溫:120 ℃;去溶劑氣體流速:600 L / h;一級質(zhì)譜掃描范圍:100 ~ 2 000 m / z。

    2 結(jié) 果

    確認(rèn)到rhGH-Fc 中Fc 和rhGH 的正確二硫鍵連接。其中 1 ∶T6-1 ∶T16、1 ∶T20-1 ∶T21 為 rhGH 的鏈內(nèi)二硫鍵,二硫鍵連接為:Cys53-Cys165,Cys182-Cys189,見圖 1~ 圖 6 和表 2。1 ∶T22-2 ∶T22 為 Fc 的鏈間二硫鍵,此肽段上有4 個(gè)半胱氨酸,形成2 組二硫鍵,二硫鍵連接為:1 ∶Cys210-2 ∶Cys210,1 ∶Cys213-2 ∶Cys213,見圖 7~ 圖 9 和表 2;1 ∶T24-1 ∶T29、1 ∶T36-1 ∶T41 為Fc 的鏈內(nèi)二硫鍵,二硫鍵連接為:Cys245-Cys305,Cys351-Cys409,見圖 10 ~ 圖 15 和表 2。

    圖1 T6-T16 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.1 Chromatogram of total ion flow of T6-T16 disulfide bond

    圖6 T20-T21 二硫鍵的二級圖譜Fig.6 Secondary profile of T20-T21 disulfide bond

    圖7 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.7 Chromatogram of total ion flow of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

    圖9 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫鍵的二級圖譜Fig.9 Secondary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

    圖10 T24-T29 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.10 Chromatogram of total ion flow of T24-T29 disulfide bond

    圖15 T36-T41 二硫鍵的二級圖譜Fig.15 Secondary profile of T36-T41 disulfide bond

    表2 通過軟件確認(rèn)的各組合物二硫鍵Tab.2 Disulfide bonds in various compositions confirmed by software

    圖2 T6-T16 二硫鍵的一級圖譜Fig.2 Primary profile of T6-T16 disulfide bond

    圖3 T6-T16 二硫鍵的二級圖譜Fig.3 Secondary profile of T6-T16 disulfide bond

    圖4 T20-T21 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.4 Chromatogram of total ion flow of T20-T21 disulfide bond

    圖5 T20-T21 二硫鍵的一級圖譜Fig.5 Primary profile of T20-T21 disulfide bond

    圖8 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫鍵的一級圖譜Fig.8 Primary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

    圖11 T24-T29 二硫鍵的一級圖譜Fig.11 Primary profile of T24-T29 disulfide bond

    圖12 T24-T29 二硫鍵的二級圖譜Fig.12 Secondary profile of T24-T29 disulfide bond

    圖13 T36-T41 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.13 Chromatogram of total ion flow of T36-T41 disulfide bond

    圖14 T36-T41 二硫鍵的一級圖譜Fig.14 Primary profile of T36-T41 disulfide bond

    3 討 論

    本研究采用Waters QTof 液質(zhì)聯(lián)用儀對rhGHFc 的二硫鍵進(jìn)行解析,確認(rèn)rhGH-Fc 中rhGH 的二硫鍵連接為 Cys53-Cys165,Cys182-Cys189;rhGH-Fc中 Fc 的二硫鍵連接為 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210,1 ∶Cys213-2 ∶Cys213,Cys245-Cys305,Cys351-Cys409,其中 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210 和 1 ∶Cys213-2 ∶Cys213 為 Fc 的鏈間二硫鍵,其他為鏈內(nèi)二硫鍵,與理論信息一致。表明具有高分辨率和高準(zhǔn)確度的LC-MS 技術(shù)可有效對蛋白一級結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行分析[9-12]。

    hGH 由人腦垂體前葉的嗜酸性細(xì)胞分泌,含有191 個(gè)氨基酸分子,相對分子質(zhì)量為22 125,具有種屬特異性,是人類出生后促生長最重要的一種蛋白質(zhì)類激素[13],正確的二硫鍵連接可影響其活性[14]。

    Fc 片段是保持rhGH-Fc 在體內(nèi)半衰期較長的主要因素,同時(shí)可影響蛋白穩(wěn)定性[15]。由于rhGHFc 的鏈間二硫鍵易水解[16],易形成單體,影響其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性,對Fc 片段的二硫鍵進(jìn)行鑒定顯得尤為重要。

    rhGH-Fc 被胰酶酶切成不同分子量大小的肽段,有半胱氨酸的肽段通過-S-S-連接成兩個(gè)肽段,經(jīng)質(zhì)譜檢測后能夠獲得含有-S-S-肽段的總離子流色譜圖(total ion chromatograms)、肽段一級圖譜和二級圖譜,通過軟件對這些肽段的圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,鑒定到二硫鍵連接的位點(diǎn)。本研究無需對樣品進(jìn)行額外的標(biāo)記,裸露出來的巰基可通過IAM 封閉,避免樣品處理過程中產(chǎn)生錯(cuò)配的二硫鍵,且二硫鍵連接肽段無N 糖位點(diǎn),僅通過對樣品的酶解肽段進(jìn)行分析,即可實(shí)現(xiàn)對樣品二硫鍵連接的確認(rèn)。

    綜上所述,本方法簡單易用,能夠快速、準(zhǔn)確、有效地的確認(rèn)rhGH-Fc 二硫鍵連接,也為其他融合蛋白的二硫鍵分析提供了思路。

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