卡介苗生產(chǎn)工藝、質(zhì)量、使用現(xiàn)狀及新型結(jié)核病疫苗的發(fā)展趨勢(shì)

蔣加慶，景輝 綜述，李秀玲 審校

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，上海201403

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是危害人類健康的重要傳染病。TB 常發(fā)生在貧窮、邊緣和社會(huì)地位低下群體以及相關(guān)社區(qū)，在欠發(fā)達(dá)國(guó)家中是比較嚴(yán)重的傳染?。?-3］。WHO 報(bào)告顯示，每年感染TB 的人數(shù)以千萬(wàn)計(jì)，卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）仍是目前世界上唯一預(yù)防TB 的疫苗，對(duì)兒童中的結(jié)核性腦膜炎及播散性TB 具有較好的預(yù)防作用，能預(yù)防原發(fā)性TB［3-4］。有研究顯示，BCG 的預(yù)防效果對(duì)不同地區(qū)及不同人群產(chǎn)生的預(yù)防效果不同，主要對(duì)兒童預(yù)防效果明顯，但對(duì)成人預(yù)防效果不佳［5-8］。本文對(duì)TB 及BCG 免疫現(xiàn)狀，BCG 菌種特性、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)、接種和接種后異常反應(yīng)，以及發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)等作一綜述。

1 TB 現(xiàn)狀

TB 是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTB）復(fù)合群引起的慢性傳染病，該復(fù)合群包括人型、牛型、非洲、田鼠、卡氏等分枝桿菌，在臨床上最常見(jiàn)的為人型和牛型MTB。根據(jù)WHO 最新發(fā)布的《2020 全球結(jié)核病報(bào)告》顯示［3］，2019 年，全球新發(fā)TB 患者約1 000 萬(wàn)，男性多于女性，其中15 歲以上男性占56%，15 歲以下兒童占8%；全球有46.5 萬(wàn)耐利福平結(jié)核?。╮ifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB）病例，其中78%為耐多藥結(jié)核?。╩u-ltidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）病例。中國(guó)在30 個(gè)TB 高負(fù)擔(dān)國(guó)家中排名第三，患者數(shù)占8.4%，僅次于印度（26%）和印度尼西亞（8.5%）。中國(guó)每年有83.3 萬(wàn)新發(fā)TB 病例，發(fā)病率為58／10 萬(wàn)，近年總體TB 發(fā)病率呈下降趨勢(shì)［3-4］。隨著生活環(huán)境、醫(yī)療衛(wèi)生環(huán)境的改善以及BCG 的使用，我國(guó)TB 防治工作取得了一定成效。

BCG 目前仍是WHO 推薦預(yù)防TB 的唯一疫苗。自1921 年以來(lái)，BCG 使用已近百年，作為兒童免疫計(jì)劃的一部分，其接種人數(shù)超過(guò)30 億，BCG 對(duì)兒童中的結(jié)核性腦膜炎和播散性TB 具有很好的預(yù)防作用［1，5］，可降低重癥 TB 的風(fēng)險(xiǎn)。新生兒接種 BCG的保護(hù)效果已得到充分肯定，保護(hù)作用可持續(xù)10 ～15 年；但BCG 對(duì)成人肺結(jié)核的預(yù)防作用效果不一，保護(hù)效果為0~80%。全球TB 總體發(fā)病率下降并不明顯，可能與接種BCG 15 年后保護(hù)作用明顯減弱有關(guān)［6-8］。另外，BCG 對(duì)已感染 MTB 患者無(wú)效［9-11］。

BCG 是由牛型MTB 經(jīng)過(guò)幾百代反復(fù)傳代培養(yǎng)減毒獲得，存在一定的不足和局限性。多次反復(fù)傳代培養(yǎng)，導(dǎo)致牛型MTB 毒力明顯減弱，同時(shí)也導(dǎo)致保護(hù)性抗原不同程度丟失［12-15］；環(huán)境中MTB 感染所致免疫致敏對(duì)BCG 免疫保護(hù)作用也存在一定程度的減弱影響［13］；另外，各種抗結(jié)核藥物的使用導(dǎo)致MTB 耐藥菌出現(xiàn)，增加了治療的難度，也給全球TB 的防控帶來(lái)難度［3-4］；因此急需研制出新型TB 疫苗。

2 BCG 使用現(xiàn)狀

2.1 BCG 菌種概況 BCG 原始菌株來(lái)自巴斯德研究所，經(jīng)過(guò)不同國(guó)家不同實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期傳代后，BCG菌株在基因特性、免疫原性和毒力等方面已經(jīng)形成了顯著的差異。世界上目前主要的BCG 生產(chǎn)用菌株分別為巴斯德1173P2 株、丹麥1331 株、日本172 株、莫斯科 254 株、巴西株等［13-17］，大多數(shù)國(guó)家使用丹麥株、日本株和莫斯科株制備疫苗。我國(guó)現(xiàn)用BCG 菌株源自1948 年引進(jìn)的丹麥BCG823 株，其中北京生物制品研究所保存的823 株為D1（丹麥1）株，上海生物制品研究所（簡(jiǎn)稱上海所）保存的823 株為 D2（丹麥 2）株。1974 年，上海所改用沙膜傳代取代馬鈴薯傳代方法對(duì)D2 株進(jìn)行傳代，發(fā)現(xiàn)新生兒淋巴結(jié)反應(yīng)率顯著降低，且陽(yáng)轉(zhuǎn)率高于其他株。1993 年，中國(guó)統(tǒng)一采用D2 株進(jìn)行BCG 生產(chǎn)。目前D2 株也是中國(guó)唯一的BCG 生產(chǎn)用菌株（BCG D2PB302 菌株）。

國(guó)際上不同菌株均特異性缺失序列RD1 區(qū)，但 RD2、RD14、RD16、n-RD18 和串聯(lián)重復(fù)序列（DU1和DU2）序列缺失情況各不相同［13-17］。另外由于原始菌株非單株菌落，而是混合菌落，因此各菌株在免疫力及減毒方面均存在一定差異（見(jiàn)表1）。隨著疫苗生產(chǎn)用菌株傳代次數(shù)的增加，菌株的毒性和免疫原性降低，為確保疫苗質(zhì)量穩(wěn)定性，WHO建議BCG 自主種子批開啟至終產(chǎn)品傳代應(yīng)不超過(guò)12 代［18-19］。

表1 世界主要BCG 菌株的基因特性Tab.1 Genetic characteristics of main BCG strains in the world

2.2 BCG 生產(chǎn)工藝 BCG 常規(guī)生產(chǎn)過(guò)程包括菌種開啟及傳代、菌體收集研磨、定量稀釋制備原液及半成品、分裝（安瓿）、凍干、充氮熔封等工藝過(guò)程。BCG 菌體培養(yǎng)主要包括表面浮膜培養(yǎng)和深層培養(yǎng)兩種方式，其中部分歐美國(guó)家采用深層培養(yǎng)方式，而大多數(shù)國(guó)家包括中國(guó)則采用表面浮膜培養(yǎng)法，菌體在液體培養(yǎng)基表面靜止懸浮培養(yǎng)。我國(guó)原液生產(chǎn)工藝可分為菌種開啟、傳代培養(yǎng)及菌膜收集、研磨兩個(gè)階段，工作種子批菌種在蘇通培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)傳代，擴(kuò)增傳代至特定代次后，使用菌膜收集器收集菌膜，低溫下研磨分散菌體后，加入適量無(wú)致敏原穩(wěn)定劑稀釋成一定濃度的BCG 菌體原液，定量稀釋制備半成品，然后安瓿分裝、凍干和封口，即為 BCG 成品［20-23］。

2.3 BCG 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) WHO 于2013 年發(fā)布的計(jì)劃免疫用疫苗技術(shù)規(guī)范WHO TRS979 中，BCG 質(zhì)量控制內(nèi)容包含了種子批、生產(chǎn)過(guò)程和成品等方面質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。《中國(guó)藥典》三部（2020 版）中BCG 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本涵蓋了 WHO 建議內(nèi)容［23］，《歐洲藥典》9.0版則與WHO 建議內(nèi)容存在較大差異［22］。

在種子批質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)方面［23-24］，WHO 推薦項(xiàng)目包括鑒別試驗(yàn)、安全試驗(yàn)（細(xì)菌和真菌污染檢查、無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)、過(guò)度皮膚反應(yīng)試驗(yàn)）、效力試驗(yàn)（遲發(fā)超敏反應(yīng)）、菌株特性試驗(yàn)（抗生素敏感性）等6項(xiàng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；《中國(guó)藥典》三部（2020 版）包括鑒別試驗(yàn)、安全性試驗(yàn)（純菌檢查、毒力試驗(yàn)、無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)）和效力試驗(yàn)（免疫力試驗(yàn)）等5 項(xiàng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)?！稓W洲藥典》9.0 版僅包括鑒別試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)項(xiàng)目（細(xì)菌和真菌污染檢查和無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)）等共3 項(xiàng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。各藥典主要差異在于，《歐洲藥典》不涉及效力試驗(yàn)，WHO 推薦采用以細(xì)胞免疫反應(yīng)為標(biāo)記的結(jié)核菌素遲發(fā)超敏反應(yīng)作為效力指標(biāo)，而《中國(guó)藥典》采用MTB 攻毒后BCG 免疫動(dòng)物臟器菌量的降低作為效力指標(biāo)。

在生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)方面［23-24］，WHO 推薦項(xiàng)目包括濃度測(cè)定、活菌數(shù)測(cè)定和安全性試驗(yàn)（細(xì)菌和真菌污染檢查、無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)）等4 項(xiàng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，《歐洲藥典》與《中國(guó)藥典》均不在生產(chǎn)過(guò)程中涉及無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)。我國(guó)設(shè)置了半成品沉降率質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，反應(yīng)菌體均勻性，通過(guò)沉降率大小反應(yīng)菌體收集過(guò)程中研磨的程度，與濃度和活菌數(shù)指標(biāo)同時(shí)控制，避免菌塊過(guò)大、菌體過(guò)多、活菌數(shù)過(guò)高導(dǎo)致的臨床異常反應(yīng)。目前快速確認(rèn)BCG 活菌情況的方法主要包括 ATP 和 XTT 法［25-26］，《中國(guó)藥典》三部（2020 版）在半成品檢定項(xiàng)目中設(shè)置了XTT 活力檢定項(xiàng)目，定性快速確認(rèn)活菌情況。

在成品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)方面［23-25］，WHO 推薦項(xiàng)目包括9 項(xiàng)，《歐洲藥典》5 項(xiàng)，《中國(guó)藥典》10 項(xiàng)。兩個(gè)國(guó)家藥典主要的質(zhì)控項(xiàng)目的差異在于過(guò)度皮膚反應(yīng)，該項(xiàng)目同樣涉及種子批的檢定。中國(guó)食品藥品檢定研究院曾對(duì)我國(guó)BCG 生產(chǎn)用工作種子批、國(guó)內(nèi)兩家企業(yè)生產(chǎn)的多批BCG 疫苗成品進(jìn)行了該項(xiàng)目的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國(guó)皮內(nèi)注射用BCG 菌種工作種子批和成品的過(guò)度皮膚反應(yīng)直徑及活菌數(shù)與國(guó)家參考品無(wú)差異，我國(guó)BCG 制品的過(guò)度皮膚反應(yīng)程度也低于國(guó)外疫苗制品，推斷過(guò)度皮膚反應(yīng)與菌種、濃度、均勻度及活菌數(shù)均有關(guān)。我國(guó)BCG 生產(chǎn)規(guī)程中，通過(guò)對(duì)濃度、沉降率、活菌數(shù)的控制，可從生產(chǎn)過(guò)程中控制成品引起皮膚反應(yīng)的程度［27］。另外《中國(guó)藥典》三部（2020 版）還規(guī)定了對(duì)成品進(jìn)行熱穩(wěn)定性考察，應(yīng)達(dá)到一定活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求。

《疫苗管理法》第一章總則第5 條規(guī)定：疫苗上市許可持有人應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)疫苗全生命周期質(zhì)量管理，對(duì)疫苗的安全性、有效性和質(zhì)量可控性負(fù)責(zé)［28］。疫苗有效性和安全性指標(biāo)是疫苗生產(chǎn)質(zhì)量管理的核心，其中與BCG 有效性相關(guān)的質(zhì)量控制指標(biāo)主要為活菌數(shù)、穩(wěn)定性和效力指標(biāo)；與BCG 安全性相關(guān)的質(zhì)量控制指標(biāo)主要為濃度、沉降率、活菌數(shù)、純菌檢查等。上述指標(biāo)均與生產(chǎn)過(guò)程密切相關(guān)，在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)做好監(jiān)控和指標(biāo)數(shù)據(jù)趨勢(shì)分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和評(píng)估超趨情況，采取相應(yīng)措施［20-22，29］。

2.4 BCG 的接種 BCG 的接種途徑為皮內(nèi)注射，注射時(shí)針尖稍向下壓，與皮膚平行刺入皮內(nèi)，注射后可見(jiàn)一圓凸丘皰［30-31］。目前我國(guó)BCG 劑型主要為5次人用劑量 ／ 支，每人皮內(nèi)注射量為0.1 mL（含卡介菌0.05 mg），考慮到針頭和管壁殘留量，1 支5 次人用劑量BCG 通常僅能接種3 ~ 4 人。

BCG 接種技術(shù)要求高、操作難度大，如果注射過(guò)淺易使藥液滲漏而影響注射劑量準(zhǔn)確性，注射過(guò)深易引起B(yǎng)CG 相關(guān)異常反應(yīng)，且5 人份BCG 存在交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。為便于醫(yī)護(hù)人員使用，改善新生兒接種體驗(yàn)，建議引入新型注射工具，如無(wú)針或微針注射器等。無(wú)針注射器在發(fā)達(dá)國(guó)家已逐步應(yīng)用于臨床醫(yī)療及家庭保健等方面，具有無(wú)針、無(wú)痛、便攜、微量、高效及安全等特點(diǎn)，基本解決了有針注射造成的疼痛、恐懼等問(wèn)題，直接避免了針刺傷害、醫(yī)療垃圾和潛在的交叉感染［32］。疫苗接種使用無(wú)針注射器的需求會(huì)越來(lái)越多，新型接種注射器在BCG 接種方面未來(lái)具有較好的應(yīng)用前景，可配合疫苗及稀釋水開發(fā)新的產(chǎn)品包裝形式。

我國(guó)是TB 高負(fù)擔(dān)國(guó)家，人口眾多，幅員遼闊，現(xiàn)有的5 人份疫苗工藝和質(zhì)量成熟穩(wěn)定，可滿足每年的計(jì)劃免疫需求指標(biāo)。隨著《疫苗管理法》的出臺(tái)實(shí)施［28］、疫苗全程信息追溯要求的提高，5 人份規(guī)格BCG 難以滿足最小包裝方式的可追溯性法規(guī)要求，達(dá)不到一苗對(duì)一人的追溯性，且有超量誤種風(fēng)險(xiǎn)，因此建議開展單人份BCG 研制。但由于產(chǎn)品分裝量過(guò)低，單人份BCG 的研制需重點(diǎn)關(guān)注凍干工藝及產(chǎn)品穩(wěn)定性和均一性等難題。

2.5 BCG 接種后異常反應(yīng) BCG 接種后的正常反應(yīng)為接種部位在2 ~ 3 周后出現(xiàn)硬結(jié)（約10 mm）、紅腫、化膿，在6 ~ 12 周后愈合并出現(xiàn)結(jié)痂，形成卡疤，共歷時(shí)2 ~ 3 個(gè)月，一般不會(huì)出現(xiàn)全身反應(yīng)，少數(shù)可出現(xiàn)接種同側(cè)腋下淋巴結(jié)輕微腫大，但直徑不會(huì)超過(guò) 10 mm［33］。

BCG 的常見(jiàn)異常反應(yīng)包括局部膿腫、淋巴結(jié)炎、結(jié)核疹和播散性卡介菌感染等，其中淋巴結(jié)炎是我國(guó)主要的異常反應(yīng)癥狀。異常反應(yīng)通常需要進(jìn)行治療，對(duì)于不同異常反應(yīng)采用適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǎ?4-36］。BCG 異常反應(yīng)的不同主要是受到BCG 本身的生物特性、接種劑量、接種途徑以及人體特異性免疫過(guò)程差異等因素影響，如何確保新生兒接種的安全性，控制BCG 接種的異常反應(yīng)情況，已成為眾多醫(yī)護(hù)人員研究的重點(diǎn)。從產(chǎn)品本身而言，則應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注分散度、均一性（如濃度、活菌數(shù)、穩(wěn)定性、沉降率）以及污染控制指標(biāo)。

3 BCG 及新型TB 疫苗的研究

3.1 BCG 的非特異性保護(hù)作用 除預(yù)防TB 外，BCG可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的非特異性免疫應(yīng)答，對(duì)其他一些疾病具有一定的非特異性免疫作用。有研究報(bào)道，BCG 及其相關(guān)制品能夠降低5 歲以下兒童瘧疾的發(fā)病率，可降低白血病、肺癌等患病風(fēng)險(xiǎn)，可減少糖尿病、阿爾茲海默癥的發(fā)生，能降低麻風(fēng)病、布魯里潰瘍和骨髓炎患病風(fēng)險(xiǎn)，可降低新生兒、嬰兒的全因死亡率，可預(yù)防新生兒敗血癥和呼吸道感染，還對(duì)非肌肉侵入性膀胱癌具有輔助治療作用［3，37-40］。BCG 對(duì)于近期肆虐全球的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）可能有一定的非特異性預(yù)防保護(hù)效果［41-42］。

目前關(guān)于BCG 非特異性免疫保護(hù)機(jī)制方面的研究主要包括異源性T 細(xì)胞免疫機(jī)制和“受訓(xùn)免疫”機(jī)制等［37-40］。其中異源性T 細(xì)胞免疫機(jī)制主要原理為T 細(xì)胞可識(shí)別結(jié)構(gòu)相似的抗原表位，不同疫苗、病原體可能會(huì)有相似的抗原表位，使其可預(yù)防肺結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌感染?！笆苡?xùn)免疫”機(jī)制依賴于細(xì)胞編程，是指在初次感染或疫苗接種后，在病原體再次入侵時(shí)固有免疫細(xì)胞可迅速產(chǎn)生炎癥因子，使其對(duì)肺結(jié)核以外的其他感染有一定預(yù)防作用。BCG非特異性保護(hù)廣泛作用也提示，任何決定終止大規(guī)模接種BCG 或取代BCG 的國(guó)家或地區(qū)行為舉措，應(yīng)把BCG 非特異性保護(hù)作用考慮在內(nèi)。

3.2 新型TB 疫苗的研究進(jìn)展 當(dāng)今TB 新疫苗研究方向應(yīng)該是對(duì)不同的人群采用不同的疫苗免疫策略，學(xué)者們的研究思路基本集中在替代BCG 的初免疫苗、BCG 初免后加強(qiáng)用疫苗和治療性疫苗［43］。TB疫苗的設(shè)計(jì)通常需要遵循兩種策略：首先是通過(guò)向其基因組中添加一些MTB 抗原來(lái)改善BCG；其次是對(duì)涉及編碼MTB 抗原的人工DNA 序列的設(shè)計(jì)或重組蛋白的設(shè)計(jì)，包括與增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑分子結(jié)合的一種或幾種抗原［44-48］。與前10 年相比，基于不同設(shè)計(jì)策略的數(shù)10 種下一代TB 疫苗已進(jìn)入臨床前和臨床試驗(yàn)的過(guò)程。目前有14 種新型TB 疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)［3］，疫苗類型包括病毒載體疫苗、亞單位／ 佐劑疫苗、分枝桿菌減毒活疫苗、分枝桿菌滅活全菌體或提取物疫苗。見(jiàn)表2。

表2 全球正在進(jìn)行臨床研究的新型TB 疫苗Tab.2 Novel TB vaccines in clinical study worldwide

3.3 病毒載體疫苗 新型TB 載體疫苗是以對(duì)人體相對(duì)安全的病毒為載體，將具有免疫保護(hù)性的特異抗原編碼基因重組至病毒載體基因組中而制備的疫苗，可通過(guò)高效連續(xù)表達(dá)來(lái)獲得免疫保護(hù)力。目前新型TB 疫苗進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)的Ad5 Ag85A、ChAdOx1 85A MVA85A（ID ／ IM ／ Aerosol）和進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)的TB ／ Flu-04L 候選疫苗均為病毒載體疫苗。

Ad5 Ag85A 疫苗是一種表達(dá)Ag85A 的腺病毒血清型5 載體疫苗，試驗(yàn)結(jié)果顯示，肌內(nèi)注射安全，耐受性良好，能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并且在先前接種過(guò)BCG 的志愿者中觀察到了更加強(qiáng)效的免疫原性，能更有效地增強(qiáng)多功能CD4+和CD8+T 細(xì)胞的免疫力［49-51］。目前正在對(duì)接種過(guò)BCG 的健康志愿者開展霧化吸入接種的安全性和免疫原性研究。ChAdOx185A MVA85A（ID ／IM ／Aerosol）疫苗中，Ch-AdOx185A 是猿猴腺病毒，MVA85A 是重組痘病毒，二者均表達(dá)抗原85a，目的是通過(guò)全身和黏膜途徑加強(qiáng)異源免疫［52］。該疫苗由英國(guó)牛津大學(xué)研制，目前正在開展的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，重點(diǎn)對(duì)青少年和成年人進(jìn)行ChAdOx1 85A 劑量增加和年齡降低之后的安全性和免疫原性研究，后續(xù)擬進(jìn)行Ⅱa 期隨機(jī)試驗(yàn)，研究目的為比較ChAdOx1 85A 和MVA85A的免疫原性與BCG 疫苗接種的免疫原性。TB ／ Flu-04L疫苗是一種基于表達(dá)抗原Ag85A 和ESAT-6 的減毒復(fù)制缺陷型流感病毒載體的黏膜載體疫苗，目標(biāo)使用人群為嬰兒、青少年和成人，作為預(yù)防性加強(qiáng)型疫苗［53］，目前正在開展Ⅱb 期臨床試驗(yàn)。

3.4 亞單位 ／ 佐劑疫苗 與完整的病原體疫苗相比，亞單位疫苗中僅包含部分抗原成分，免疫反應(yīng)較弱，常與佐劑一起使用，亞單位／ 佐劑疫苗是研究的一個(gè)熱點(diǎn)。由于MTB 表達(dá)約4 000 種蛋白質(zhì)，免疫靶點(diǎn)較多，現(xiàn)在亞單位疫苗中常用的分泌蛋白包括ESAT6、Rv 系列、Ag85B 和 Ag85A 等。目前新型 TB疫苗進(jìn)入Ⅰ期臨床階段的AEC ／ BC02 和進(jìn)入Ⅱ期臨床階段的 ID93 + GLA-SE、GamTBvac、H56：IC31和M72 ／ AS01E 候選疫苗均為亞單位 ／ 佐劑疫苗。

AEC ／ BC02 疫苗是一種由重組 Ag85B 和融合蛋白 ESAT-6、CFP-10 與 CpG（來(lái)自 BCG）和明礬鹽基佐劑組成的凍干重組疫苗［54-55］，由中國(guó)安徽智飛龍科馬公司研發(fā)，正在18 ~ 45 歲健康成人受試者中進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。ID93 + GLA-SE 疫苗含有4 種MTB 抗原和佐劑GLASE，其中抗原包含3 種毒力抗原（Rv2608，Rv3619 和 Rv3620）和 1 種潛伏期相關(guān)抗原（Rv1813）。在南非完成的一項(xiàng)Ⅱa 期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，2 μg ID93 + 5 μg GLA-SE 兩劑接種后誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性體液免疫應(yīng)答及CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)應(yīng)答明顯高于安慰劑組，未觀察到疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良事件［56-57］。目前正在進(jìn)行Ⅱb 期臨床試驗(yàn)。GamTBvac 疫苗是由右旋糖酐結(jié)合域修飾的Ag85a和ESAT6-CFP10 抗原與CpG ODN 佐劑組成的重組亞單位疫苗，擬用于BCG 初免后的加強(qiáng)免疫。Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示了較好的安全和免疫原性，目前正在俄羅斯進(jìn)行Ⅱ期臨床研究［58］。H56：IC31 疫苗由 3 種MTB 抗原（Ag85B，ESAT-6 和 Rv2660c）與 IC31c 佐劑組成。Ⅰ期或Ⅰ／Ⅱa 期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗具有可接受的安全性，目前正在坦桑尼亞聯(lián)合共和國(guó)和南非進(jìn)行Ⅱb 期試驗(yàn)，評(píng)估其預(yù)防TB 復(fù)發(fā)的效果［59］。M72 ／ AS01E 疫苗由兩種 MTB 抗原（32a 和39a）與佐劑（AS01E）組成。在肯尼亞、南非和贊比亞進(jìn)行的Ⅱb 期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，3 年疫苗保護(hù)效力為 50%（90%CI：12% ~ 71%），如果該研究結(jié)果在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，則其可能改變?nèi)騎B 預(yù)防工作［60-62］。

3.5 重組BCG 減毒活疫苗 重組BCG 減毒活疫苗是使用基因工程技術(shù)，將一段編碼特異性抗原的基因?qū)胫罛CG 菌株中，大量產(chǎn)生高免疫活性抗原，提高其免疫保護(hù)效果。VPM1002 疫苗是一種攜帶細(xì)胞李斯特菌溶素（Hly）而自身缺失脲酶素C 基因的重組BCG，可增強(qiáng)CD4+和CD8+T 細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，提高宿主自防御能力［63］。疫苗在南非接觸和未接觸艾滋病病毒新生兒中的安全性及免疫原性的Ⅱ期臨床試驗(yàn)已成功完成，隨后的Ⅲ期臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中［64］。印度正在實(shí)施預(yù)防成人TB 復(fù)發(fā)的Ⅱ ／ Ⅲ期臨床試驗(yàn)［3］。印度一項(xiàng)旨在評(píng)估VPM1002 在痰涂片陽(yáng)性TB 患者健康家庭接觸者中預(yù)防肺結(jié)核的有效性和安全性的Ⅲ期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中［3］。

3.6 MTB 減毒活疫苗 MTB 減毒活疫苗是利用基因工程技術(shù)，刪除MTB 中的一些毒性基因，獲得致病性基因缺失減毒疫苗，全菌體疫苗可顯著表達(dá)多種免疫活性抗原，顯示出較強(qiáng)的免疫效力。MTBVAC是由西班牙薩拉戈薩大學(xué)和Biofabri 公司開發(fā)的一種活的通過(guò)刪除phoP 和fadD26 基因而減毒MTB菌株［65］，其主要目標(biāo)是替代BCG，次要目標(biāo)作為加強(qiáng)疫苗。MTBVAC 含有BCG 中缺失的大部分基因，因此其向宿主免疫系統(tǒng)提供了更廣泛的MTB 抗原集合，MTBVAC 是第一種通過(guò)臨床評(píng)估的減毒活TB疫苗，顯示出與BCG 相似的安全性。2018 年完成的一項(xiàng)Ⅰb 期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，MTBVAC 具有可接受的免疫原性，并在嬰兒中誘導(dǎo)了持久的抗原特異性T-helper-1 細(xì)胞因子表達(dá)CD4 細(xì)胞應(yīng)答，該應(yīng)答在接種后70 d 達(dá)到高峰，在接種后360 d 可檢測(cè)到；對(duì)于最高 MTBVAC 劑量（即 2.5 × 105CFU），接種后360 d，免疫反應(yīng)超過(guò)了同等劑量BCG 誘導(dǎo)的反應(yīng)。確定最佳MTBVAC 劑量的安全性和免疫原性是試驗(yàn)進(jìn)展的關(guān)鍵，目前已經(jīng)在南非完成了新生兒MTBVAC 的劑量確定安全性和免疫原性研究Ⅱa 期臨床試驗(yàn)（待公布）。MTBVAC 對(duì)有或無(wú)MTB 潛伏感染成人的接種效果的Ⅰb ／ Ⅱa 期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，這是一項(xiàng)針對(duì)144 名有或無(wú)潛伏性結(jié)核感染（latent TB infection，LTBI）的健康成年人進(jìn)行的雙盲、隨機(jī)、劑量遞增的安全性和免疫原性研究［3，66-67］。

3.7 分枝桿菌滅活全菌體或提取物疫苗 分枝桿菌滅活全菌體疫苗主要是采用加熱、化學(xué)劑等物理化學(xué)方法殺死活菌而制備的疫苗，雖然效力比活菌株低，但其危險(xiǎn)性相對(duì)較小，主要是以BCG 或其他分枝桿菌為載體的滅活疫苗，其中DAR-901 疫苗和MIP疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。分枝桿菌滅活菌體細(xì)胞提取物疫苗是將MTB 部分組分提取后滅活，其中RUTI?疫苗已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

DAR-901 疫苗是一種熱滅活的全細(xì)胞非結(jié)核分枝桿菌加強(qiáng)疫苗，Ⅰ期臨床試驗(yàn)證實(shí)其具有良好的安全性，目前正在進(jìn)行Ⅱb 期臨床試驗(yàn)；坦桑尼亞聯(lián)合共和國(guó)的Ⅲ期試驗(yàn)結(jié)果顯示了其在成人艾滋病病毒感染者中的保護(hù)效果，目前正在進(jìn)行Ⅱb 期臨床試驗(yàn)，研究其對(duì)BCG 致敏青少年感染的預(yù)防效果［3，68-69］。MIP 疫苗也稱為Immuvac，為印度開發(fā)的一種非致病性細(xì)菌［70］，已被印度藥品監(jiān)督管理局和FDA 批準(zhǔn)為免疫治療和免疫預(yù)防制劑，用于治療多桿菌麻風(fēng)患者（作為標(biāo)準(zhǔn)多藥療法的輔助療法），并用于預(yù)防麻風(fēng)患者密切接觸者之間的麻風(fēng)病發(fā)展。印度醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)正在印度實(shí)施一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)，評(píng)估Immuvac 在痰涂片陽(yáng)性TB 患者的健康家庭接觸者中預(yù)防肺結(jié)核的有效性和安全性［3］。RUTI?疫苗是一種基于MTB 細(xì)胞壁碎片化的滅活疫苗［71］，由滅活的MTB 的全部碎片組分去除毒素后包裹在脂質(zhì)體內(nèi)研制而成，與抗生素聯(lián)用可提高耐多藥TB患者的治愈率。針對(duì)健康志愿者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)和針對(duì)TB 感染者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了其良好的安全性。東歐、印度已分別批準(zhǔn)其在耐多藥TB患者中進(jìn)行Ⅱa、Ⅱb 期臨床研究［3］。

4 展 望

BCG 為目前世界上唯一可用于預(yù)防TB 的疫苗，自1921 年開始用于人類，至今已使用100 年，疫苗使用穩(wěn)定，安全可靠。對(duì)于我國(guó)現(xiàn)有在用的5 人份BCG，需關(guān)注菌種的遺傳穩(wěn)定性，加強(qiáng)生產(chǎn)工藝過(guò)程控制，了解國(guó)內(nèi)外質(zhì)量差異性，開展質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)分析，關(guān)注疫苗的臨床使用和異常反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)和分析確?，F(xiàn)有BCG 產(chǎn)品的生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定性、安全性和有效性。另外建議可在現(xiàn)有BCG 工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行技術(shù)改良，研制單人份BCG，最大可能性地實(shí)現(xiàn)最小劑量包裝單位疫苗的可追溯性；臨床使用新型注射器，如無(wú)針或微針注射器，改善兒童使用體驗(yàn)和接種感受，降低接種風(fēng)險(xiǎn)和異常反應(yīng)發(fā)生率。

BCG 的非特異性保護(hù)作用逐漸被發(fā)現(xiàn)新的作用，雖然機(jī)理目前尚不明確，但任何國(guó)家或地區(qū)想要終止或取代BCG 時(shí)，應(yīng)將BCG 的非特異性保護(hù)作用考慮在內(nèi)。目前雖然TB 的治療成果已有大幅度提高，但TB 仍然是危害人類健康的重要疾病?，F(xiàn)有BCG 預(yù)防不充分、多重耐藥TB 和治療手段不足仍是面臨的問(wèn)題，只有通過(guò)開發(fā)新的技術(shù)手段和研制新型的TB 疫苗，才能逐步消滅TB，實(shí)現(xiàn)2050 年消除肺結(jié)核的全球公共遠(yuǎn)大目標(biāo)［72］。

全球正在為開發(fā)新型抗TB 疫苗而努力，目前有10 多種處在不同人類臨床試驗(yàn)階段的候選疫苗，還有其他TB 疫苗候選藥物正處于臨床前階段。從免疫策略角度，新型TB 疫苗候選者主要為初免疫苗、增強(qiáng)型疫苗和治療性疫苗，三類疫苗策略基本涵蓋了當(dāng)前新型疫苗的方向［48，73］。其中初免疫苗主要為減毒活疫苗，如MTBVAC 減毒活疫苗和VPM1002重組BCG 疫苗等，全菌體減毒活疫苗可提供更加全面的免疫保護(hù)力；增強(qiáng)型疫苗多為亞單位／ 佐劑疫苗、病毒載體疫苗和分枝桿菌滅活全菌體疫苗等，如Ad5 Ag85A、AEC ／BC02、M72 ／AS01E 和 DAR-901疫苗等，能夠誘導(dǎo)高強(qiáng)度表達(dá)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，在BCG 疫苗接種后可作為增強(qiáng)劑，增加療效并延長(zhǎng)免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間；治療性疫苗應(yīng)對(duì)潛伏感染的MTB有明顯的治療性，如RUTI?疫苗，與傳統(tǒng)化學(xué)藥物協(xié)同使用能夠提高耐多藥TB 患者的治愈率。

成功開發(fā)一種普遍有效的新型TB 疫苗仍面臨重大挑戰(zhàn)，主要面臨的困難有：如何選擇合適的具有免疫原性的抗原表位是疫苗研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)；動(dòng)物評(píng)估模型存在限制，利用動(dòng)物模型很難完全模擬臨床感染狀態(tài)；疫苗的評(píng)估終點(diǎn)存在爭(zhēng)議，缺乏明確的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義終點(diǎn)事件；不同人群疫苗有效性存在差異，不同人群年齡、地理位置和基因等異質(zhì)性；TB疫苗的研究和開發(fā)缺乏資金和資源，根據(jù)2018 年聯(lián)合國(guó)數(shù)據(jù)，用于TB 研究的資金仍僅為每年所需的20億美元的 1 ／ 2［44，46，74］。WHO 曾提出成人用預(yù)防性TB 疫苗保護(hù)率應(yīng)不低于 50%，M72 ／ AS01E 疫苗Ⅱ期臨床試驗(yàn)的良好結(jié)果讓人們看到了希望。

TB 疫苗的設(shè)計(jì)是20 世紀(jì)免疫學(xué)家最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一，常規(guī)的疫苗開發(fā)方法不足以抵抗復(fù)雜的病原體MTB，新的開發(fā)方法需要基于對(duì)MTB 與人體免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用的新的認(rèn)知。在可預(yù)見(jiàn)的將來(lái)，隨著我們對(duì)MTB 與宿主的相互作用的了解不斷深入，希望能夠推動(dòng)計(jì)算機(jī)疫苗的設(shè)計(jì)及測(cè)試，這將加速疫苗設(shè)計(jì)的過(guò)程。新型的抗TB 疫苗的開發(fā)已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，相信在不久的將來(lái)，用于人類預(yù)防和治療的新型TB 疫苗可能成為現(xiàn)實(shí)。