重組H5N1 流感血凝素桿狀病毒滴度熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立、驗(yàn)證及應(yīng)用

吳清勝，吳相英，姚春萍，李媛媛，

1.國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司，北京101111；2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京100176

桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（baculovirus expressionvector system，BEVS）是以桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲細(xì)胞為受體的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，具有效率高、容量大、表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行折疊和修飾等特點(diǎn)［1-3］。自20 世紀(jì)80 年代建立以來，BEVS 已經(jīng)發(fā)展為成熟的生物制品生產(chǎn)平臺(tái)，有多種產(chǎn)品獲批，包括獸用疫苗、人用疫苗及治療產(chǎn)品［4-8］。桿狀病毒不會(huì)刺激哺乳動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，也不會(huì)對(duì)其造成功能性損傷，這些特性使其成為一種極具應(yīng)用前景的基因治療載體［9］。無論是疫苗研發(fā)，還是基因治療［10-11］，桿狀病毒滴度的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)均至關(guān)重要，熒光定量PCR（qPCR）法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)［12-14］。本文通過設(shè)計(jì)H5 基因的引物及探針，以Bacmid-H5 重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板，對(duì)PCR 的退火溫度及引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測(cè)H5 基因拷貝數(shù)的qPCR 法，并對(duì)該方法的專屬性、重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，確定線性范圍及檢測(cè)限，并應(yīng)用該方法和免疫熒光法［15］對(duì)H5 桿狀病毒連續(xù)傳代4 次及連續(xù)培養(yǎng)0 ～6 d 的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌株、病毒及細(xì)胞 含重組rBacmid-H5 的E.coli菌株DH10Bac 由國藥中生研究院有限責(zé)任公司第七研究室制備，重組H5 桿狀病毒、重組H1 桿狀病毒、未重組桿狀病毒均由該室制備；Sf9 昆蟲細(xì)胞購自ATCC。

1.2 主要試劑及儀器 SFX-Insect 培養(yǎng)基購自美國GE 公司；EASY Dilution（for Real Time PCR）、Probe qPCR Mix 購自日本TaKaRa 公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；LB Brothready to use 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DNeasy?Blood&Tissue Kit 購自德國 QIAGEN 公司；StepOnePlus Real-time PCR System 購自美國ABI公司；Eppendorf BioPhotometer D30 核酸蛋白測(cè)定儀購自德國Eppendorf 公司。

1.3 引物及探針 H5 基因上游引物（HA-F）：5′-tac gcc gct gac aag gaa ag-3′，下游引物（HA-R）：5′-ggt cca cac gtc cag gaa ac-3′；Tanqman 熒光探針：5′-act cag aag gcc atc gac ggc gtg ac-3′。均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 將rBacmid-H5 重組菌接種至含三抗（卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素終濃度分別為 50、7、10 μg ／ mL）的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜；12 000 ×g離心 5 min，收集菌體；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒Bacmid-H5，充分混勻，利用Eppendorf BioPhotometer D30 核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)，按公式①計(jì)算質(zhì)粒濃度，將Bacmid-HA 重組質(zhì)粒的堿基數(shù)4 007 bp 代入公式②得出copies。分裝凍存于-20 ℃。

1.5 方法的建立

1.5.1 退火溫度優(yōu)化 以提取的質(zhì)粒 rBacmid-H5 為標(biāo)準(zhǔn)模板，（53 ± 5）℃為退火溫度，進(jìn)行梯度PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。最亮的電泳條帶所對(duì)應(yīng)的退火溫度為最佳退火溫度。

1.5.2 引物濃度優(yōu)化 根據(jù)線性范圍，在高濃度模板（8.5 × 109copies ／ μL）和適中濃度模板（2.3 ×106copies／μL）下，分別加入0.5、1、2、3μL 的10mmol ／ L引物進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。選取Ct值最低（熒光值最高）的引物濃度為最佳引物濃度。

1.6 方法的驗(yàn)證

1.6.1 專屬性 將反應(yīng)體系確定為25 μL，包括10 μmol／L 的上、下游引物、探針各 1 μL，模板 1 μL，Probe qPCR Mix（2 ×）12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，注射用水 8 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

以10 倍系列稀釋的rBacmid-H5 質(zhì)粒為模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以相同提取方法制備的重組H5 桿狀病毒的基因組DNA 為待檢樣品，以EASY Dilution稀釋液為空白對(duì)照，驗(yàn)證方法的專屬性。以重組H5桿狀病毒基因?yàn)殛栃詫?duì)照，PBS 為陰性對(duì)照，qPCR法檢測(cè)重組H1 桿狀病毒和未重組的桿狀病毒基因組DNA，重復(fù)2 次，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.6.2 線性范圍及檢測(cè)限 用EASY Dilution 對(duì)模板進(jìn)行稀釋，擴(kuò)大濃度范圍（7.36 × 10-3～ 8.5 ×109copies ／ μL），進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)，確定線性范圍及檢測(cè)限。

1.6.3 重復(fù)性 將重組H5 桿狀病毒于27℃，120r／min搖瓶培養(yǎng)3 d；接種至傳代后1 d 的Sf9 細(xì)胞（活細(xì)胞密度為 1.86 × 106cells ／ mL，活率為 98.92%），取培養(yǎng)3 d 后的細(xì)胞（活細(xì)胞密度為1.77×106cells／mL，活率為47.62%）進(jìn)行檢測(cè)。在線性范圍內(nèi)，將2.3×109copies ／ μL（即 10 μg ／ mL）的模板 10 倍稀釋至2.3 × 103copies ／ μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用 qPCR 法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)6 次。

1.7 方法的初步應(yīng)用 采用qPCR 法對(duì)重組H5 桿狀病毒連續(xù)傳代4 次［培養(yǎng)3 d 左右（活率約50%）傳代，病毒與細(xì)胞體積比為1︰10］及連續(xù)培養(yǎng)0 ～6 d 的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與免疫熒光法進(jìn)行比較［15］。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)模板 rBacmid-H5 質(zhì)粒濃度為 37.5 μg／mL，拷貝數(shù)為 8.536 1 × 109copies ／ μL。

2.2 方法的建立

2.2.1 退火溫度 退火溫度在48.8 ～57.2 ℃（中點(diǎn)為53 ℃）范圍內(nèi)，均可見目的擴(kuò)增條帶。根據(jù)目的條帶深淺，并結(jié)合引物的Tm 值，選取55 ℃為最佳退火溫度。見圖1。

圖1 溫度梯度PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of temperature gradient PCR product

2.2.2 引物濃度 適中濃度模板時(shí)，加入0.5、1、2和3 μL 的引物，Ct值差異不明顯；高濃度模板時(shí)，加入 1 μL 的引物，Ct值較低，見圖 2 和表 1。因此，最佳引物使用量確定為 1 μL 10 mmol ／ L 引物。

圖2 不同濃度引物的定量PCR 反應(yīng)熒光強(qiáng)度曲線Fig.2 Fluorescent intensity curve of qPCR at various primer concentrations

表1 兩種模板濃度下不同濃度引物的Ct 值Tab.1 Ct values of primers at different concentrations using templates at two concentrations

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 qPCR 法檢測(cè)重組H1 及未重組的桿狀病毒（不含外源基因），均無熒光信號(hào)，見表2。表明該方法特異性良好，不與未重組的桿狀病毒和流感病毒的其他亞型發(fā)生交叉反應(yīng)。

表2 不同亞型重組流感桿狀病毒qPCR 法檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of recombinant baculovirus with influnenza virus of different subtypes by qPCR

2.3.2 線性范圍及檢測(cè)限 模板濃度在1.15×103～4.25× 109copies／μL 之間，線性關(guān)系良好，R2=0.999，見圖 3。模板濃度低于 1.15 × 103copies ／ μL，偏離線性范圍，檢測(cè)值與陰性對(duì)照區(qū)分不明顯。見表3。確定檢測(cè)限為 1.15 × 103copies ／ μL。

圖3 線性范圍及檢測(cè)限的試驗(yàn)數(shù)據(jù)圖Fig.3 Experimental data graph of linear range and detection limit

表3 線性范圍及檢測(cè)限的確定Tab.3 Determination of linear range and detection limit

2.3.3 重復(fù)性 重組H5 桿狀病毒培養(yǎng)3 d，重復(fù)檢測(cè)6 次，RSD為1.01%，見表4，表明重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性驗(yàn)證Tab.4 Validation for reproducibility

2.4 方法的初步應(yīng)用 H5 桿狀病毒連續(xù)傳代4 次，病毒滴度保持相對(duì)穩(wěn)定，qPCR 法的檢測(cè)值高于免疫熒光法，見表5；H5 病毒連續(xù)培養(yǎng)0 ～6 d，病毒滴度在第3 天達(dá)到較高值，qPCR 法的檢測(cè)值高于免疫熒光法，見表6。

表5 H5 桿狀病毒連續(xù)傳代 4 次的病毒滴度（copies ／ mL）Tab.5 Detection results of titer of H5 baculovirus subcultured for four passages（copies ／ mL）

表6 H5 桿狀病毒連續(xù)培養(yǎng) 0 ～ 6 d 的病毒滴度（copies ／ mL）Tab.6 Detection results of titer of H5 baculovirus cultured for 0 ～ 6 d（copies ／ mL）

3 討 論

重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中可能會(huì)丟失目的基因，產(chǎn)生缺陷干擾病毒（defective interfering particles，DIs）［16-18］，導(dǎo)致外源蛋白的表達(dá)量顯著降低［19］。應(yīng)用Bac-to-Bac 技術(shù)構(gòu)建的重組桿狀病毒，遺傳不穩(wěn)定性更加明顯［20］。這些缺陷顆粒的產(chǎn)生和不斷積累，會(huì)嚴(yán)重影響目的蛋白的產(chǎn)量［21］。本研究建立的qPCR 方法，能夠特異性的檢測(cè)H5 基因。該方法通過檢測(cè)外源基因得到定量結(jié)果，為有效的重組病毒含量，避免了缺陷性病毒顆粒對(duì)檢測(cè)值的干擾。

測(cè)定桿狀病毒滴度的方法主要有蝕斑法、終點(diǎn)稀釋法、免疫染色法、流式細(xì)胞術(shù)法、實(shí)時(shí)定量熒光PCR 法（real-time qPCR）等。基于核酸的檢測(cè)和免疫測(cè)定方法是病毒檢測(cè)常用的方法。免疫染色法或免疫熒光染色法，在培養(yǎng)3 d 后，再包括加入一抗、二抗等多個(gè)步驟，每步操作均可能對(duì)滴度檢測(cè)值產(chǎn)生影響。實(shí)際檢測(cè)中，形成的熒光斑點(diǎn)大小不一，經(jīng)常存在多個(gè)斑點(diǎn)聚集的大斑點(diǎn)，而且需要?jiǎng)趧?dòng)強(qiáng)度較大的人工顯微鏡下斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，由于對(duì)斑點(diǎn)的取舍以及可能存在多計(jì)或者漏記，因此人為讀數(shù)誤差較大；此外，檢測(cè)中，還發(fā)現(xiàn)滴度與細(xì)胞代次或細(xì)胞狀態(tài)有一定關(guān)系，這也是重復(fù)性較差的因素之一。

疫苗的生產(chǎn)過程中，一般需對(duì)病毒滴度進(jìn)行快速檢測(cè)，或?qū)ε囵B(yǎng)過程中，病毒滴度的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。免疫熒光法耗時(shí)較長，而qPCR 法具有快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于工藝的穩(wěn)定性控制具有重要意義。qPCR 法檢測(cè)的為基因copies，如果待檢樣品中存在缺陷病毒或者死病毒，檢測(cè)值將會(huì)偏高；在實(shí)際應(yīng)用中，qPCR 法可作為快速檢測(cè)方法進(jìn)行應(yīng)用，滿足時(shí)效性要求，而準(zhǔn)確的滴度值可再應(yīng)用其他方法進(jìn)行復(fù)檢（蝕斑法或免疫法）。然而，對(duì)于特定產(chǎn)品，在成熟工藝或者GMP 生產(chǎn)條件下，培養(yǎng)參數(shù)、保存條件和保存時(shí)間相對(duì)固定，病毒的活力會(huì)相對(duì)穩(wěn)定，批間差異小，基因拷貝數(shù)與病毒活力之間的關(guān)系或者比值較為固定，qPCR 法檢測(cè)的參考意義將更大。