桿狀病毒載體滅活方法的研究進(jìn)展

伊立超，婁安鋼

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

桿狀病毒基因組為大型環(huán)狀閉合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，桿狀病毒科包含顆粒體病毒屬（Granulovirus, GV）和核型多角體病毒屬（Nucleopolyhedrovirus, NPV），形態(tài)表現(xiàn)為桿狀，寬約30～60 nm，長約250～300 nm，主要以包涵體來源病毒（Occlusionderivedvirus, ODV）和出芽型來源病毒（Buddingvirus, BV）[1]。

昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Insect cellbaculovirus expression system, IC-BVES）的應(yīng)用越來越廣泛，特別是在抗體研發(fā)、疫苗生產(chǎn)、生物防治[2]方面都有較多的研究和相關(guān)成果。在疫苗研發(fā)方面，對重組桿狀病毒滅活后進(jìn)行免疫的研究日趨增加，本文就桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、常用桿狀病毒滅活方法及免疫效果作以綜述。

1 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

1.1 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的主要組分

pFastBac?載體，目的基因的表達(dá)由（AcMNPV）多角體（PH）或p10啟動(dòng)子控制，表達(dá)框中包含慶大霉素抗性基因和SV40多聚腺苷酸化信號，以形成mini-Tn7。DH10Bac?大腸桿菌作為載體的宿主菌，細(xì)胞中含有桿狀病毒穿梭載體（桿粒）和輔助質(zhì)粒。pFastBac?表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10Bac?細(xì)胞后，mini-Tn7元件與桿粒上的mini-atTn7靶位點(diǎn)之間發(fā)生轉(zhuǎn)座（輔助質(zhì)粒提供了轉(zhuǎn)座蛋白）。

1.2 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的主要特點(diǎn)

作為真核表達(dá)系統(tǒng)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)和其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，有其獨(dú)特的特點(diǎn)：

（1）表達(dá)效率高。重組桿狀病毒能在昆蟲細(xì)胞系及昆蟲體內(nèi)高效表達(dá)目的蛋白[3]，最高可達(dá)細(xì)胞總蛋白的50 %，表達(dá)量高是其重要特點(diǎn)。

（2）基因容量大。雙表達(dá)載體可以表達(dá)兩段不同的外源基因，也可用不同的重組桿狀病毒同時(shí)感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)不同目的蛋白。另外桿狀病毒基因組在核衣殼內(nèi)折疊延伸，可以容納較大外源基因插入[4]。

（3）翻譯后加工修飾充分。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可對翻譯后的蛋白進(jìn)行磷酸化、糖基化[5]、信號肽切除等修飾，使蛋白接近天然產(chǎn)物并提高其生物學(xué)活性。

（4）生物安全性高。桿狀病毒感染具有很高的種屬特異性，只感染昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物，對哺乳動(dòng)物及周圍環(huán)境無害[6-8]。

1.3 桿狀病毒表達(dá)基本流程

將目的基因克隆至pFastBac?供體質(zhì)粒，生成pFastBac?重組體，將重組體轉(zhuǎn)化入DH10Bac?細(xì)胞中，獲得含有重組桿粒的大腸桿菌集落，可再次涂布集落以確認(rèn)其中含有重組桿粒，將含重組桿粒的集落接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取重組桿粒DNA，采用Cellfectin?Ⅱ試劑轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，獲得P1重組桿狀病毒庫，感染昆蟲細(xì)胞擴(kuò)增病毒，獲得至P3重組桿狀病毒庫，滴定測得重組桿狀病毒滴度后感染懸浮昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。

2 常用桿狀病毒滅活方法

2.1 甲醛滅活法

甲醛滅活原理是使微生物的蛋白質(zhì)、核酸變性，導(dǎo)致微生物死亡，不再有感染性，但不明顯影響其免疫原性。

胡波[9]將兔出血癥病毒VP60基因構(gòu)建到pFastBac?1供體質(zhì)粒上，獲得P3重組桿狀病毒庫之后，按照體積比1 % 接種感染懸浮SF9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，加入終濃度0.2 % 的甲醛溶液滅活24 h，滅活后將細(xì)胞培養(yǎng)物接種于SF9昆蟲細(xì)胞中，培養(yǎng)5 d盲傳一代后，檢測細(xì)胞培養(yǎng)物血凝性，驗(yàn)證是否滅活完全。

2.2 β-丙內(nèi)酯（BPL）滅活法

β-丙內(nèi)酯（BPL）直接與病毒核酸作用，而不作用于殼蛋白，不破壞病原體的免疫原性。

肖琦[10]將圓環(huán)病毒2型cap基因構(gòu)建到pFastBac?Dual供體質(zhì)粒上，獲得P3重組桿狀病毒庫之后，按照最佳感染復(fù)數(shù)1 MOI接種感染懸浮High Five昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，-20 ℃ 反復(fù)凍融3次，加入終濃度0.50‰β-丙內(nèi)酯，置于4 ℃ 振搖12 h，滅活后37 ℃ 水浴2 h去除β-丙內(nèi)酯。按照體積比1 % 將滅活后的細(xì)胞培養(yǎng)物接種于SF9細(xì)胞中，培養(yǎng)5 d后觀察細(xì)胞病變情況，細(xì)胞有病變則將細(xì)胞培養(yǎng)物-20 ℃ 反復(fù)凍融3次后進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定；無病變則將細(xì)胞培養(yǎng)物 -20 ℃ 反復(fù)凍融3次后再次接種，到第3次之后進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定，驗(yàn)證滅活完全。

3 結(jié)論

文章對桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)及重組桿狀病毒滅活方法進(jìn)行了綜述。制備動(dòng)物滅活病毒疫苗應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)方法是用甲醛[11]，但對免疫動(dòng)物有一定的應(yīng)激性[12-13]。最近β-丙內(nèi)酯的滅活研究較多，其滅活效果比甲醛強(qiáng)25倍[14]，一定劑量對動(dòng)物有致癌性，但在37 ℃ 環(huán)境中其極易水解為無毒性物質(zhì)[15-16]。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用越來越廣泛，合適的滅活方法和滅活條件需要更多嘗試，其中最關(guān)鍵是是滅活完全及減少重組桿狀病毒的損失。