基于多重PCR定性鑒別鹿肉摻假

邵博宇，徐寧，遲凱月，于文瑩，高麗君*，艾金霞，羅雁非，李明成，3

1(北華大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林，132013)2(長春海關(guān)技術(shù)中心，吉林 長春，130062) 3(北華大學(xué)吉林省中藥DNA指紋檢測技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林，132013)

梅花鹿是我國多種珍稀藥材的來源動物，梅花鹿養(yǎng)殖業(yè)是我國新興的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)之一[1]。隨著日常生活質(zhì)量的提高，人們除了食用常見的豬肉、牛肉、雞肉和鴨肉外，還增加了鹿肉及其肉制品的食用。鹿肉有低脂肪、高蛋白和低膽固醇等優(yōu)點，梅花鹿肉與馬鹿肉的營養(yǎng)成分含量相似，但梅花鹿肉的蛋白質(zhì)含量明顯高于馬鹿肉[2-3]。我國的食鹿歷史源遠(yuǎn)流長，從周朝時期就有食用鹿肉的文字記載，《名醫(yī)別錄》中記載鹿肉可治療中風(fēng)，李時珍在《本草綱目》中寫道“鹿肉味甘，溫，無毒，益氣力，強(qiáng)五臟，養(yǎng)血生容”[4]。2011年，國家批準(zhǔn)鹿肉可作為普通食品供大眾食用，鹿肉制品工業(yè)開始迅猛發(fā)展。各種鹿肉加工制品，如鹿肉醬、鹿肉丸、鹿肉腸等逐漸進(jìn)入大眾的視野[5]。隨著鹿肉市場日漸高漲，不法商家以豬肉、牛肉等廉價肉類摻入鹿肉干及鮮鹿肉中，嚴(yán)重擾亂了鹿肉制品市場的秩序，影響鹿肉及其制品的食品安全。

近年來，肉類的鑒別摻假有理化性質(zhì)分析方法，如近紅外光譜法分析樣品的特征性光譜區(qū)分不同物種的肉，和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析物種的特異性多肽[6-7]；或是以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法以及膠體金免疫層析法，檢測特異性蛋白鑒別摻假，但鹿肉經(jīng)過加工制作后，蛋白發(fā)生變性就難以對其進(jìn)行鑒別[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA檢測技術(shù)被廣泛用于物種的鑒別中[9-10]。本研究采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)對鮮梅花鹿肉或鹿肉干中的豬肉、牛肉進(jìn)行鑒別與常規(guī)PCR相比，多重PCR既有單一PCR的特異性和敏感性，且更為便捷，相較于實時熒光PCR，其價格也更為低廉；并且在引物和設(shè)計PCR的反應(yīng)條件上的靈活性也更強(qiáng)，可實現(xiàn)一步檢測出梅花鹿肉、牛肉、豬肉3種動物肉源性成分。選擇本方法目的是建立一種高效穩(wěn)定、簡便實用的鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品于2020年10月購入，消毒處理后保存于-20 ℃條件下。梅花鹿(Cervusnippon)肉購于長春市雙陽區(qū)鴻博鹿產(chǎn)品經(jīng)銷公司；豬肉、牛肉、驢肉、狗肉、羊肉、雞肉、鴨肉購于吉林市江灣農(nóng)貿(mào)市場。

2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、Ultra GelRed(10 000×)，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；100 bp DNA Marker、λDNA Hind Ⅲ，天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖，西班牙Agrose公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY300E通用型電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ETC811 PCR基因擴(kuò)增儀，蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；GeneAmp R PCR System 2700 Applied Biosystem，美國Perkin-Elmer 公司；UV WHITE2020D凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-rad公司；Q6000微量紫外分光光度計，美國Quawell公司。

1.3 樣品DNA提取

采用堿變性方法提取基因組DNA[11]。將梅花鹿肉樣品及其他常見物種樣品組織用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇清洗3 min，37 ℃烘箱中揮發(fā)乙醇，用剪刀剪碎至約1 mm3。稱取樣品0.1 g放入離心管中，加入500 μL裂解液、15 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和30 μL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，混勻后置于56 ℃水浴振蕩2 h，轉(zhuǎn)速為100 r/min。直接向裂解后的樣品中加入500 μL飽和乙酸鈉溶液，充分混勻，11 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液加入等體積的異丙醇，-20 ℃放置1 h，11 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，留沉淀。用洗滌液(主要含有(體積分?jǐn)?shù))70%的乙醇)洗滌沉淀2～3次，干燥沉淀，加滅菌雙蒸水80 μL進(jìn)行溶解，于-20 ℃下保存，作為DNA模板。將提取的樣品DNA用微量紫外分光光度計測定濃度，根據(jù)OD260/OD280的值鑒定純度。

1.4 梅花鹿肉及其它物種肉樣品檢測

1.4.1 樣品DNA純度及濃度測定

用微量紫外分光光度計測定提取的樣品DNA濃度，根據(jù)OD260/OD280的比值鑒定所提取DNA的純度。

1.4.2 樣品DNA瓊脂糖凝膠電泳

配制質(zhì)量濃度為8 g/L的膠，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed[1 μL染料/10 mL 1×三羥甲基氨基甲烷-硼酸鹽-乙二胺四乙酸(tris-borate-ethylene diamine tetraacetic acid，TBE)]；PCR反應(yīng)溶液的上樣量為6 μL，電壓85 V/cm。取凝膠于紫外分析儀上進(jìn)行檢視。

1.5 三重PCR引物

根據(jù)文獻(xiàn)[12-14]選擇針對梅花鹿、豬、牛3個物種的PCR特異性引物。

表1 三重PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度Table 1 Triplex PCR primer sequence and extended segment length

1.6 三重PCR檢測

1.6.1 三重PCR引物特異性

單重PCR反應(yīng)體系為2×TaqPCR Mix 酶12.5 μL，所提取的常見動物樣品DNA溶液(100 ng/μL)1 μL，各物種的正向、反向引物(12.5 ng/μL)各0.5 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。將PCR反應(yīng)管放置于PCR儀。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。

1.6.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測

配制質(zhì)量濃度為15 g/L的膠，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed(1 μL染料/10 mL 1×TBE)；PCR反應(yīng)溶液的上樣量為5 μL，6×Loading buffer上樣量為1 μL，電壓85 V/cm。取凝膠于紫外分析儀上進(jìn)行檢視。

1.6.3 三重PCR退火溫度檢測

三重PCR反應(yīng)體系為2×TaqPCR Mix 酶12.5 μL，模板(100 ng/μL)4 μL，牛、豬的正向、反向引物(12.5 ng/μL)各0.2 μL，梅花鹿的正向、反向引物(12.5 ng/μL)各0.6 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。將PCR反應(yīng)管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s，54～63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進(jìn)行檢測。

1.6.4 三重PCR特異性檢測

采用1.6.3的體系，同時加入梅花鹿、豬、牛3個物種、兩兩組合、單一物種以及常見動物DNA進(jìn)行PCR檢測特異性。PCR反應(yīng)管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進(jìn)行檢測。

1.6.5 三重PCR重復(fù)性檢測

采用1.6.4中的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，同一操作人員不同時間重復(fù)試驗5次。PCR反應(yīng)管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃)5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進(jìn)行檢測。

1.6.6 三重PCR靈敏度檢測

用所提取的DNA先稀釋到100 ng/μL，然后按照1∶10倍比稀釋作為DNA模板，取單一物種DNA模板和3個物種DNA模板，用1.6.4中的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件檢測三重PCR靈敏性。PCR反應(yīng)管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進(jìn)行檢測。

1.6.7 三重PCR混合DNA驗證

提取鹿肉、豬肉、牛肉DNA，然后按比例混合制作成不同鹿肉DNA濃度百分比的模擬混合DNA，用1.6.4中的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件驗證三重PCR。PCR反應(yīng)管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進(jìn)行檢測。

1.6.7 三重PCR混合肉樣驗證

將鹿肉、豬肉、牛肉切碎至肉糜狀后按比例混合制作成不同鹿肉質(zhì)量百分比的模擬混合肉樣，對混合肉進(jìn)行DNA提取，用1.6.4中的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件驗證三重PCR。PCR反應(yīng)管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物基因組DNA提取結(jié)果

8 g/L(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，各個泳道都可觀察到23 kp左右的條帶，且條帶清晰明亮，證明本研究提取DNA的方法效率高，質(zhì)量好，碎片較少，可以高效提取各種動物組織的基因組DNA(圖1)。

2.2 提取動物DNA濃度和純度

將提取的樣品DNA用微量紫外分光光度計測定其濃度，結(jié)果如表2所示。由表2可知，利用該方法提取DNA效果良好；根據(jù)OD260/OD280判斷所提取DNA的純度，所得比值為1.8～2.0時符合進(jìn)行PCR實驗的要求，本方法提取各動物DNA純度均在理想范圍內(nèi)。

M-Marker；N-陰性對照；1-梅花鹿；2-豬；3-牛；4-驢；5-狗；6-羊；7-雞；8-鴨圖1 提取動物基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis patterns of various animal DNA

表2 實驗用動物樣品基因組DNA的濃度及純度Table 2 Concentration and purity of genomic DNA of experimental animal samples

2.3 引物特異性結(jié)果

由圖2可知，梅花鹿、豬、牛所對應(yīng)泳道分別在525、212、116 bp處有單一的特異性條帶，明亮清晰。結(jié)果表明，3對引物均有良好的特異性。

M-Marker；N-陰性對照；1-牛；2-豬；3-梅花鹿；4-驢；5-羊；6-狗；7-雞；8-鴨a-牛引物；b-豬引物；c-梅花鹿引物圖2 各引物特異性的PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR reaction product specific to each primer

2.4 三重PCR檢測結(jié)果

2.4.1 退火溫度結(jié)果

退火溫度分別為54、55、56、57、58、59、60、61 ℃，由電泳圖(圖3)可知，在58 ℃時，PCR產(chǎn)物最清晰明亮，且3個條帶亮度一致。故選擇58 ℃作為三重PCR反應(yīng)條件的最佳溫度。

M-Marker；1-54 ℃；2-55 ℃；3-56 ℃；4-57 ℃；5-58 ℃；6-59 ℃；7-60 ℃；8-61 ℃；9-62 ℃；10-63 ℃圖3 不同退火溫度PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR reaction products at different annealing temperatures

2.4.2 特異性結(jié)果

由圖4可知，梅花鹿、豬、牛三重PCR分別在525、212、116 bp處有清晰明亮的條帶，梅花鹿、豬、牛3個物種兩兩配對及單一物種加入到三重體系中也表現(xiàn)出良好的特異性。

2.4.3 重復(fù)性結(jié)果

由圖5可知，同一體系和反應(yīng)條件下，同一操作人員不同時間進(jìn)行的三重PCR產(chǎn)物條帶清晰明亮，結(jié)果均一致，三重PCR重復(fù)性良好。

2.4.4 靈敏度結(jié)果

由圖6可知，，當(dāng)三重體系只加入單一物種，梅花鹿DNA質(zhì)量濃度在10 ng/μL時，牛DNA質(zhì)量濃度在1 ng/μL時，豬DNA質(zhì)量濃度在1 ng/μL時，條帶清晰；當(dāng)三重體系中有梅花鹿、牛、豬3個物種時，三者的質(zhì)量濃度在100 ng/μL時，條帶清晰明亮，當(dāng)質(zhì)量濃度小于10 ng/μL時，有條帶但不清晰。

M-Marker；N-陰性對照；1-梅花鹿+豬+牛；2-梅花鹿+牛；3- 豬+牛；4-梅花鹿+豬；5-牛；6-梅花鹿；7-豬；8-雞；9-鴨；10-驢；11-羊；12-狗圖4 三重PCR特異性反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis pattern of specific reaction products of triplex PCR

M-Marker；N-陰性對照；1-20201107；2-20201114；3-20201121；4-20201128；5-20201205圖5 三重PCR重復(fù)性反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.5 Agarose gel electrophoresis pattern of repetitive reaction products of triplex PCR

M-Marker；N-陰性對照；1-100 ng/μL；2-10 ng/μL；3-1 ng/μL；4-0.1 ng/μL；5-0.01 ng/μL；6-0.001 ng/μL；7-0.000 1 ng/μLa-梅花鹿；b-豬；c-牛；d-同時加入3個物種圖6 三重PCR靈敏性反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.6 Agarose gel electrophoresis pattern of the sensitive reaction product of triplex PCR

2.4.5 三重PCR檢測混合DNA結(jié)果

由圖7可知，DNA摻假量從10%～50%的梅花鹿混合DNA樣本，均可檢測出摻假的豬肉或牛肉DNA。

2.4.6 三重PCR檢測混合肉樣結(jié)果

由圖8可知，摻假量從10%～50%的混合肉樣樣本，均可檢測出摻假的豬肉或牛肉。

a-梅花鹿肉DNA混入牛肉DNA；b-梅花鹿肉DNA混入豬肉DNA；c- 梅花鹿肉DNA混入牛肉DNA、豬肉DNAM-Marker；N-陰性對照；P-陰性對照；1-10%；2-15%；3-20%；4-25%；5-30%；6-40%；7-50%圖7 三重PCR混合DNA反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.7 Agarose gel electrophoresis pattern of the mix DNA reaction product of triplex PCR

a-梅花鹿肉摻入豬肉；b-梅花鹿肉摻入牛肉；c-梅花鹿肉摻入牛肉和豬肉M-Marker；N-陰性對照；P-陰性對照；1-5%；2-10%；3-15%；4-20%；5-25%；6-30%；7-40%；8-50%圖8 三重PCR混合肉樣反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.8 Agarose gel electrophoresis pattern of the mix meat reaction product of triplex PCR

3 結(jié)論與討論

在我國，梅花鹿是傳統(tǒng)的藥用性動物之一，在東北地區(qū)多見。以梅花鹿各部分為原材料的中藥產(chǎn)品在臨床中并不少見，我國中藥學(xué)對于梅花鹿的利用有較久的歷史依據(jù)[15]。如今，梅花鹿也作各種鹿產(chǎn)品中的最佳原料而受到廣大人民的喜愛[16]。梅花鹿身體各部位入藥，制作成食品和藥膳越來越常見，梅花鹿肉營養(yǎng)價值高，可藥食兩用，可與中草藥搭配制作藥膳，烹飪方式多種多樣。鹿肉在中藥材和食用方面有著悠久的歷史，但目前沒有相關(guān)的行業(yè)規(guī)定和法律法規(guī)，導(dǎo)致市場上出現(xiàn)以次充好、以假亂真的現(xiàn)象。所以，研究一種針對鹿肉摻假定性的方法顯得尤其重要。

梅花鹿產(chǎn)品的鑒定方法在近些年研究甚廣，從對鹿茸[17]、鹿血[18]、鹿胎[19]、鹿鞭[20]等各種部位進(jìn)行鑒別，到應(yīng)用PCR、實時熒光定量PCR[21]、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[22]等分子鑒定手段進(jìn)行鑒別；有基于單核苷酸多態(tài)性基因座，設(shè)計梅花鹿等位基因特異性PCR鑒定的特異性引物，可用于快速，準(zhǔn)確地鑒定梅花鹿源性成分[23]；還有通過DNA條形碼這種新興的鑒定體系對梅花鹿進(jìn)行快速鑒定[24]。以上方法可以準(zhǔn)確地鑒定出梅花鹿動物源性成分，但目前沒有方法可以同時鑒別出梅花鹿、豬、牛3種成分。

多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，針對不同物種的基因同時擴(kuò)增出多個核酸片段的一種PCR反應(yīng)。這種技術(shù)能夠高效地用一份動物樣本或加工炮制的中藥或藥膳成品同時區(qū)分梅花鹿、豬、牛3種動物源性成分，相較于其他鑒定方法，此方法在同一反應(yīng)管中檢出，既節(jié)省時間及成本，又可以提供更加準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。在單一引物PCR和三重PCR實驗中，各引物均表現(xiàn)出良好的特異性。通過退火溫度實驗，摸索出三重PCR反應(yīng)的最佳條件。本方法表現(xiàn)出了很好的重復(fù)性和靈敏性，能在6 h內(nèi)完成從提取DNA到PCR檢測結(jié)果的全部過程，特異性高、準(zhǔn)確度好、靈敏性強(qiáng)，操作簡單易行，能夠很大程度上減少質(zhì)檢人員的工作量，在混合DNA和混合肉樣檢測中，也表現(xiàn)出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。本方法所用試劑及儀器較為常見，適用于各級別質(zhì)檢單位，可以廣泛用于梅花鹿、牛、豬的肉源性產(chǎn)品，具有很高的實用性和長遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究建立了一種快速靈敏、簡單易行的鑒定方法，為解決鹿肉中摻假成分的鑒別問題提供新途徑。