人參、三七和西洋參多重PCR方法建立及應(yīng)用

汪香君，劉墨祎，李迎，汪洺卉，范馨元，王添琦，劉麗梅

(北華大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林，132013)

五加科人參屬植物人參(Panaxginseng)、三七(Panaxnotoginseng)和西洋參(Panaxquinquefoliusm)是我國常用的珍貴中藥材。受環(huán)境影響，三者的植物形態(tài)和化學(xué)成分具有一定的相似性，但藥效存在很大差異，單純依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和化學(xué)分析法鑒定植物品種不夠精確，尤其是無法對(duì)參片及參粉等參類產(chǎn)品進(jìn)行鑒定。

人參、三七和西洋參為近源物種，三者在基因上差異較小，這導(dǎo)致快速鑒定方法的開發(fā)較為困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用使得藥用植物的鑒定更為準(zhǔn)確和便捷。第三代分子標(biāo)記物單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，因其分布廣，密度高，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于藏菖蒲、枇杷、化橘紅和紫蘇等藥用植物的鑒定中[1-4]。

SNP的檢測(cè)方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性、溫度梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜、衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性、TaqMan探針技術(shù)、基因芯片和等位基因特異性PCR(allele-specific PCR, AS-PCR)等。其中AS-PCR應(yīng)用最廣，具有成本低，操作簡(jiǎn)單，便捷，快速等優(yōu)點(diǎn)，但是其不足在于特異性不強(qiáng)。本研究通過對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)修飾和引入錯(cuò)配堿基2種方式使3′末端實(shí)現(xiàn)封閉，增強(qiáng)引物特異性。建立人參、三七和西洋參的多重PCR檢測(cè)體系，并考察其在市售參類產(chǎn)品中的檢測(cè)情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試人參、西洋參及三七樣品由國家參茸檢驗(yàn)檢測(cè)中心和吉林省益盛漢參生物科技有限公司提供，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱保持樣品新鮮(表1)。常見9種市售參類產(chǎn)品：生曬參片、紅參切片、西洋參切片、三七粉、人參丸、高麗參茶、人參蜜片、紅參藥片、西洋參膠囊(圖1)。20份粗加工參類產(chǎn)品：生曬參片(5份)、紅參切片(5份)、西洋參切片(5份)、三七粉(5份)購自當(dāng)?shù)丶熬€上銷售處。

表1 樣品名稱及產(chǎn)地表Table 1 Name and producing area of samples

1-生曬參片；2-人參丸；3-高麗參茶；4-人參蜜片；5-紅參切片；6-紅參藥片；7-西洋參切片；8-西洋參膠囊；9-三七粉圖1 市售樣品Fig.1 Commercially available samples

植物DNA提取試劑盒，北京BioTeke公司；rTaq DNA聚合酶，TaKaRa TaqTM Version 2.0；PrimeSTAR HS、DL2000，大連TaKaRa公司；6×DNA Loading Buffer，天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-2050R低溫高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ETC811型基因擴(kuò)增儀，蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像分析儀，德國耶拿公司；DNA/蛋白質(zhì)分析儀，Quawell。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 特異性引物設(shè)計(jì)

本研究利用DNAMAN對(duì)比了NCBI中現(xiàn)有的人參屬植物基因序列，發(fā)現(xiàn)人參的18S rRNA序列(以KC593823.1為參照)在496、498和500位堿基處有3個(gè)SNP位點(diǎn)，人參為G、T、C，三七為C、A、G，西洋參為C、G、G。三七的rcbL序列(以GQ436707.1為參照)第212位堿基為C，而人參和西洋參為T。西洋參的psbE-petL序列(以JN700483.1為參照)第461位堿基為C，而人參和三七為T。以此為基礎(chǔ)利用Primer3設(shè)計(jì)特異性引物，使正向引物3′端位于SNP位點(diǎn)上并用LNA進(jìn)行修飾，在3′末端第二或第三堿基處引入錯(cuò)配以確保3′末端實(shí)現(xiàn)完全封閉，引物序列見表2。

表2 人參、三七、西洋參特異性鑒別引物Table 2 Specific identification primers for Panax ginseng, Panax notoginseng， and Panax quinquefolium

1.3.2 DNA提取

本研究應(yīng)用改良的CTAB法提取人參、三七和西洋參的DNA[5]，用微量核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)DNA的純度及濃度。將質(zhì)量濃度調(diào)整到10 ng/μL用于PCR擴(kuò)增。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及電泳

20 μL PCR反應(yīng)體系為：4 μL 10 ng/μL模板DNA，10 μL rTaq DNA聚合酶，人參上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，三七上下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，西洋參上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，2.6 μL去離子水，反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；59 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物加入Loading buffer后經(jīng)EB預(yù)染的20 g/L(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.3.4 熒光定量PCR

20 μL PCR反應(yīng)體系為：4 μL 10 ng/μL模板DNA，10 μL PrimeSTAR HS，人參上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，三七上下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，西洋參上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，2.6 μL去離子水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；59 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s，35次循環(huán)；每個(gè)循環(huán)在72 ℃收集熒光信號(hào)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.3.5.1 多重PCR反應(yīng)條件評(píng)價(jià)

溫馨提示：因?yàn)榘资淼牡矸酆扛?，換算成米飯的時(shí)候就不能按照4∶1了，要按3∶1才對(duì)，所以說當(dāng)你吃3份白薯的時(shí)候，你當(dāng)天吃的米飯的量就得減少1份了。

分析影響多重PCR效果的關(guān)鍵因素，包括退火溫度、循環(huán)數(shù)、DNA含量和引物含量。

1.3.5.2 多重PCR反應(yīng)體系靈敏性評(píng)價(jià)

使用ddH2O將人參、三七和西洋參的DNA濃度梯度稀釋為10～10-4ng/μL。按照1.3.3中多重PCR反應(yīng)體系，保持其中兩種模板濃度不變，使剩余一種模板濃度梯度遞減進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.6 混合樣品檢測(cè)

將人參，三七，西洋參標(biāo)準(zhǔn)品按照一定比例均勻混合，總共分成7組，Ⅰ組是3個(gè)樣品混合，人參、三七、西洋參質(zhì)量比為1∶1∶1，6∶3∶1和6∶1∶3。Ⅱ～Ⅶ組為兩兩混合，分別是人參中混入三七，人參中混入西洋參；西洋參中混入三七，西洋參中混入人參，三七中混入人參，三七中混入西洋參，其質(zhì)量比分別為1∶1，4∶1和9∶1?；旌虾玫臉悠酚酶牧嫉腃TAB法提取DNA，PCR擴(kuò)增后用20 g/L(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.3.7 市售樣品檢測(cè)

用改良的CTAB和試劑盒法提取市售9份人參制品的基因組，將濃度稀釋至10 ng/μL，按照1.3.3中多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增后用20 g/L(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

用特異性引物對(duì)人參、三七、西洋參進(jìn)行擴(kuò)增，在55～60 ℃時(shí)分別能擴(kuò)增出249、366、212 bp的特異性條帶，以此為基礎(chǔ)對(duì)影響多重PCR特異性和靈敏性的因素進(jìn)行摸索。結(jié)果表明退火溫度在58～60 ℃時(shí)人參、三七、西洋參均能產(chǎn)生特異性條帶，但在61 ℃之后西洋參特異性條帶亮度明顯降低。根據(jù)電泳條帶的亮度確定多重PCR的退火溫度為59 ℃(圖2-A)。對(duì)循環(huán)數(shù)的考察，25～40個(gè)循環(huán)時(shí)均能對(duì)人參、三七、西洋參進(jìn)行鑒別，能明顯的看出35個(gè)循環(huán)時(shí)條帶亮度最高，最清晰，且無非特異性擴(kuò)增(圖2-B)。

2.1.2 DNA含量與最適引物量

20 μL體系中模板含量分別為20、30、40、50 ng，結(jié)果人參、三七和西洋參均能擴(kuò)增出特異性條帶，多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模板量在40 ng時(shí)條帶最亮，確定DNA含量為40 ng(圖2-C)。多重PCR中，引物用量及引物間相互作用對(duì)PCR結(jié)果有重要影響，確保PCR總體系中DNA含量為40 ng，模擬混合摻假調(diào)整引物比例致使人參、三七和西洋參的擴(kuò)增效率一致。在調(diào)整引物量的過程中發(fā)現(xiàn)人參和西洋參的特異性引物擴(kuò)增效率明顯高于三七。為了確保電泳結(jié)果的清晰和準(zhǔn)確，最終確定引物配比為人參引物量∶三七引物量∶西洋參引物量體積比為 0.15 μL∶1.25 μL∶0.3 μL(圖2-D)。

M-DL 2000 DNA Marker；Pg-人參；Pn-三七；Pq-西洋參A-不同退火溫度；B-不同循環(huán)數(shù)；C-不同模板量；D-最適引物量摸索圖2 人參、三七、西洋參不同PCR反應(yīng)條件的電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of Panax ginseng, Panax notoginseng, and Panax quinquefolium under different PCR reaction conditions注：D中1～4號(hào)樣品DNA總含量為40 ng；1號(hào)樣品人參：三七：西洋參DNA含量為1∶1∶1；2號(hào)樣品人參：三七DNA含量為1∶1；3號(hào)樣品人參：西洋參DNA含量為1∶1；4號(hào)樣品三七：西洋參DNA含量為1∶1；Ⅰ～Ⅵ組人參：三七：西洋參引物量體積比分別為1∶1∶1、0.75∶1∶0.75、0.5∶1∶0.5、0.25∶1∶0.25、0.1∶1∶0.25、0.15∶1.25∶0.3

2.2 多重PCR反應(yīng)體系靈敏性評(píng)價(jià)

如圖3-A～C所示，調(diào)節(jié)人參、三七、西洋參的模板濃度，使其中任意一模板濃度梯度遞減，其余兩種模板濃度保持不變，按照最佳多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，其中人參最低檢測(cè)限可達(dá)到1 ng/μL，三七和西洋參可達(dá)到5 ng/μL。本研究所建立多重PCR檢測(cè)體系結(jié)果穩(wěn)定，當(dāng)任意一種DNA減少至5 ng/μL時(shí)，仍可準(zhǔn)確檢測(cè)，且無交叉無污染。

M-DL2000 DNA Marker；1-10 ng/μL；2-5 ng/μL；3-1 ng/μL；4-10-1 ng/μL；5-10-2 ng/μL；6-10-3 ng/μL；7-10-4 ng/μL；N-空白對(duì)照A-人參；B-三七；C-西洋參圖3 多重PCR檢測(cè)體系靈敏度檢測(cè)Fig.3 Sensitivity detection of multiplex PCR detection system

2.3 熒光定量PCR

應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)多重PCR檢測(cè)體系發(fā)現(xiàn)其能對(duì)3種樣品進(jìn)行準(zhǔn)確快速的區(qū)分，其出峰時(shí)間與片段大小密切相關(guān)(圖4)。

圖4 人參、三七和西洋參多重?zé)晒釶CR檢測(cè)Fig.4 Multiplex real-time PCR detection of Panax ginseng, Panax notoginseng， and Panax quinquefolium

2.4 混合樣品檢測(cè)

人工模擬混合樣品檢測(cè)，圖5中Ⅰ組為人參、三七、西洋參三種樣品按照不同比例混合，其余6組為2種樣品混合，提取基因組DNA后進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。各泳道僅出現(xiàn)特異性條帶，混合樣品檢出限為10%。但經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，條帶亮度并不總是隨著摻假比例的減少而增高，如圖5中Ⅲ組為人參中混入西洋參，人參和西洋參質(zhì)量比為4∶1時(shí)反而比1∶1和9∶1亮，這可能與2種樣品粉末本身質(zhì)量和基因組提取效率相關(guān)。

2.5 市售樣品檢測(cè)

應(yīng)用改良的CTAB和試劑盒法提取市售產(chǎn)品的基因組，多重PCR檢測(cè)結(jié)果表明生曬參片、紅參片、西洋參片和三七粉等粗加工產(chǎn)品的檢出率明顯高于人參蜜片和人參茶等深加工保健品。選取市場(chǎng)上不同來源的粗加工產(chǎn)品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示在16份試售產(chǎn)品中有13份與其成分相符，檢驗(yàn)陽性率達(dá)到80%(圖6)。

M-DL 2000 DNA Marker圖5 混合樣品多重PCR檢測(cè)Fig.5 Multiplex PCR detection of mixed samples注：Ⅰ組1～3號(hào)樣品中人參:三七:西洋參DNA含量體積比分別為1∶1∶1、6∶3∶1、6∶1∶3；Ⅱ組1～3號(hào)樣品中人參∶三七DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅲ組1～3號(hào)樣品中人參∶西洋參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅳ組1～3號(hào)樣品中西洋參∶三七DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅴ組1～3號(hào)樣品中西洋參∶人參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅵ組1～3號(hào)樣品中三七∶人參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅶ組1～3號(hào)樣品中三七∶西洋參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1

M-DL2000 DNA Marker；P-陽性對(duì)照；1～4-生曬參片；5～8-紅參切片；9～12-西洋參切片；13～16-三七粉；N-空白對(duì)照?qǐng)D6 市售粗加工樣品多重PCR檢測(cè)電泳圖Fig.6 Electrophoresis diagram of multiplex PCR detection of commercial rough processed samples

3 結(jié)論與討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人民生活水平和自我保健意識(shí)的提高，人參的價(jià)格和使用需求逐步增加，目前市場(chǎng)上的常見的人參產(chǎn)品有人參粉、人參片、人參顆粒和人參膠囊等。由于人參的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值較高，且人參屬植物的形態(tài)較為相似，導(dǎo)致一些商人在人參產(chǎn)品中摻入西洋參或三七等其他人參屬植物。因此人參及參類產(chǎn)品的鑒別成為目前人參研究的重點(diǎn)。研究者已開發(fā)了多種人參的分子標(biāo)記，其中包括限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat, ISSR)、和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)[6-10]。然而，上述方法均有不足之處，不適用于大批量樣本的檢測(cè)，難以自動(dòng)化，例如RFLP和AFLP操作較為繁瑣，很難比較分析，RAPD和ISSR很容易受到PCR反應(yīng)條件微小變化的影響，SSR多態(tài)性通常需要用到聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染等。

近年來，隨著下一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，表達(dá)序列標(biāo)簽的獲得和高通量技術(shù)的應(yīng)用使得SNP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用成為可能。與其他DNA分子相比SNP具有檢測(cè)假陽性率低，分布廣，密度高和具有代表性等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是簡(jiǎn)單有效的物品種鑒定方法。在人參方面的研究者中常用AS-PCR的方法檢測(cè)SNP位點(diǎn)[11-14]，通過引物3′端堿基與模板嚴(yán)格配對(duì)來實(shí)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)過程中PCR反應(yīng)體系，循環(huán)數(shù)和退火溫度等均對(duì)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)生明顯的影響，常常會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，且重復(fù)性不好。目前多采用引入錯(cuò)配的方式提高引物的特異性[15-16]。在實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)僅憑借錯(cuò)配堿基無法確保實(shí)現(xiàn)引物3′末端的完全封閉，因此在SNP位點(diǎn)處引入LNA修飾，這使得引物3′末端完全匹配與錯(cuò)配的序列Tm值間存在著顯著差異，可以將SNP更好地區(qū)分出來[17]。

9份市售樣品的檢測(cè)結(jié)果表明4份與所含原料相符，其中粗加工產(chǎn)品多重PCR檢測(cè)陽性率明顯高于深加工保健品。對(duì)市場(chǎng)上16份人參粗加工產(chǎn)品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，陽性率較高，達(dá)到80%以上。這可能存在摻假的問題，也可能由于市售樣品中藥材本身含量較低，加工過程中高溫處理導(dǎo)致DNA嚴(yán)重降解或者產(chǎn)品本身添加輔料(如蜂蜜、淀粉、蔗糖和葡萄糖等)影響DNA提取效率。

本研究利用了基于SNP位點(diǎn)的多重PCR技術(shù)建立了人參、三七和西洋參的快速檢測(cè)體系，通過LNA修飾和引入錯(cuò)配堿基的方式使3′末端實(shí)現(xiàn)完全封閉，達(dá)到增強(qiáng)引物特異性的目的，該方法靈敏度高，重復(fù)性好，基于常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳即可對(duì)樣品的成分進(jìn)行檢測(cè)，并可用于市售參類產(chǎn)品具體成分的鑒定。