基于蛋白質(zhì)-酚互作體系的核桃仁澀味評(píng)定方法

王若輝，李慶楊，劉毅華，莫潤(rùn)宏*

1(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州，311400)2(南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京，210037)

酚類物質(zhì)是植物的重要次生代謝產(chǎn)物，具有良好的抗菌、消炎和神經(jīng)保護(hù)作用[1]，還能夠改善血脂狀況，降低冠心病和心臟病的風(fēng)險(xiǎn)[2]，但其也是食物澀味的重要來(lái)源。澀味是由于酚類物質(zhì)苯環(huán)上的酚羥基與口腔內(nèi)的唾液蛋白發(fā)生反應(yīng)，觸覺(jué)機(jī)械感受器感覺(jué)到后，由三叉神經(jīng)的游離神經(jīng)末梢傳導(dǎo)刺激神經(jīng)，從而產(chǎn)生澀感[3-4]。輕度的澀味會(huì)在一定程度上豐富食物的口感，而重度的澀味往往會(huì)引起食用者的不適[5]。因此，通過(guò)研究澀味的產(chǎn)生和強(qiáng)弱對(duì)改善產(chǎn)品口感，增強(qiáng)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力有重要意義，同時(shí)可以通過(guò)市場(chǎng)認(rèn)可度來(lái)倒逼品種選育和生產(chǎn)加工向“輕澀”、“適澀”方向研究。

核桃仁中的酚主要分布在內(nèi)種皮上，雖然其在一定程度上能阻止核桃仁的酸敗氧化[6]，但也是核桃仁澀味的主要來(lái)源[7]。已有學(xué)者對(duì)核桃中酚類物質(zhì)代謝途徑[8]、核桃內(nèi)種皮澀味形成的標(biāo)志物[9]、關(guān)鍵澀味物質(zhì)[10]等方面進(jìn)行了研究，并且證實(shí)了不同品種核桃間的苦澀味物質(zhì)具有差異[7]?，F(xiàn)有研究雖初步分析了核桃中澀味物質(zhì)的代謝合成途徑、種類和結(jié)構(gòu)等，但對(duì)核桃仁澀味評(píng)定方法仍停留在感官評(píng)審法，該法易受主觀感受、個(gè)體差異、環(huán)境因子等因素的影響[11]，且隨著反復(fù)品嘗易產(chǎn)生“感受疲勞”[3]。另外，電子舌[12]雖然能克服傳統(tǒng)感官評(píng)審的缺點(diǎn)，但其無(wú)法測(cè)定滋味物質(zhì)在口腔中的釋放和持久性[13]。因此，學(xué)界近年開(kāi)始利用體外蛋白質(zhì)[牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)等模擬唾液蛋白]與酚類物質(zhì)在非競(jìng)爭(zhēng)體系下相互作用的非感官評(píng)定法對(duì)澀味進(jìn)行定量和機(jī)理的研究，該體系下蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)直接反應(yīng)后，通過(guò)蛋白的減少量來(lái)反映澀味的強(qiáng)弱[14-16]。例如，在不同葡萄酒的蛋白-酚的互作模型中，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光光譜法，并根據(jù)它們與BSA相互作用的強(qiáng)度來(lái)反映不同葡萄酒的澀味程度[15]；也有學(xué)者利用紫外-可見(jiàn)分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry, UV-vis)[16]成功鑒定了大批量的葡萄酒澀味程度。而有關(guān)競(jìng)爭(zhēng)體系下蛋白質(zhì)和小分子互作反應(yīng)的相關(guān)研究也已應(yīng)運(yùn)至食品過(guò)敏原檢測(cè)方面[17]。目前，有關(guān)非競(jìng)爭(zhēng)體系中蛋白質(zhì)-酚類物質(zhì)互作多見(jiàn)于葡萄酒等液體飲品上的澀味評(píng)定，未見(jiàn)其在核桃澀味評(píng)定中應(yīng)用，更未見(jiàn)競(jìng)爭(zhēng)體系在澀味評(píng)定中的相關(guān)報(bào)道。綜上所述，本研究根據(jù)澀感產(chǎn)生的原理建立了核桃仁內(nèi)種皮的體外蛋白質(zhì)-酚類物質(zhì)互作定量評(píng)定方法，探索了非競(jìng)爭(zhēng)體系/競(jìng)爭(zhēng)體系中紫外分光光度法、高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法對(duì)固態(tài)樣品核桃仁澀味評(píng)定的適應(yīng)性。研究結(jié)果可為核桃及其他干果澀味程度的定量評(píng)定提供參考，也為核桃品種選育和副產(chǎn)品加工改良等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用核桃樣品采自中國(guó)北方地區(qū)核桃圃。選取樹(shù)齡一致、長(zhǎng)勢(shì)良好、產(chǎn)量穩(wěn)定的不同品種核桃植株，每個(gè)品種隨機(jī)采取核桃果實(shí)50個(gè)，果實(shí)大小基本一致且飽滿。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸(均為色譜純)，德國(guó)Merck公司；丙酮、無(wú)水乙醇、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉、三氟乙酸(AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；單寧酸(AR)，美國(guó)SUPELCO公司；BSA，美國(guó)Genview公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CPA225D十萬(wàn)分位分析天平，德國(guó)Sartorius公司；SB-5200 DTD大功率超聲波水浴，寧波新芝生物科技公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；UV-3210PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司；Free Zone 6 L真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO公司；Agilent 1290高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器)，美國(guó)Agilent公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Therm公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

采收后的核桃鮮樣人工去青皮得到核桃仁，分離內(nèi)種皮和種仁。將內(nèi)種皮冷凍干燥24 h后，稱取0.5 g 于50 mL離心管中，加70%(體積分?jǐn)?shù))丙酮水溶液15 mL，均質(zhì)后超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，取上層提取液，重復(fù)3次，合并上層提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉合并提取液中的丙酮，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)剩余液體pH值至2.0，用15 mL乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，用10 mL甲醇定容，得到核桃仁內(nèi)種皮的提取液。

1.3.2 感官評(píng)審

根據(jù)已有文獻(xiàn)[18]，由3～5名身體健康、富有感官評(píng)審經(jīng)驗(yàn)的評(píng)審人員組成感官評(píng)審小組，對(duì)核桃樣品進(jìn)行澀味感官評(píng)定。評(píng)審人員統(tǒng)一在上午10∶00進(jìn)行核桃澀味評(píng)定，評(píng)審前2 h不進(jìn)食。評(píng)審員品嘗后進(jìn)行打分(1～10分)，樣品澀感越強(qiáng)，分?jǐn)?shù)越高。將3位評(píng)審員的感官澀味評(píng)分取平均，對(duì)核桃樣品進(jìn)行高(G,7.1～10分)、中(Z,4.3～7.0分)、低(D,1～4.2分)澀味程度劃分，結(jié)果如表1所示。

1.3.3 紫外法對(duì)核桃澀味定量評(píng)定

1.3.3.1 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取5.7 mL冰醋酸，加水定容至1 000 mL，用0.8 mol/mL氫氧化鈉將pH調(diào)至5，制備得到100 mol/mL醋酸緩沖液。用醋酸緩沖液分別配制7個(gè)濃度梯度的BSA溶液和單寧酸溶液，即0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mg/mL和0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的反應(yīng)液。隨后將單寧酸溶液和BSA溶液均取1 mL按梯度混合，渦旋10 s，在37 ℃條件下水浴2 h，取出后12 000 r/min離心10 min。取離心后上清液1 mL，用醋酸緩沖液1∶1(體積比)稀釋，搖勻后靜置10 min，在320 nm處測(cè)吸光值。固定單寧酸濃度，用該濃度下的BSA濃度梯度的吸光值作圖，獲得對(duì)數(shù)曲線斜率絕對(duì)值。再用單寧酸濃度梯度與該濃度下對(duì)數(shù)曲線斜率絕對(duì)值作圖，得到單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 不同品種核桃的澀味感官評(píng)分Table 1 The sensory astringency scores in different varieties of walnuts

1.3.3.2 非競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度測(cè)定

分別取樣品加樣體積梯度10、20、30、40、50、60 μL至2 mL離心管中，氮?dú)獯蹈珊蠹? mL醋酸緩沖液混勻。隨后將樣品與BSA溶液按梯度混合，按1.3.3.1余下步驟得到吸光值，確定樣品加樣體積，用該加樣體積與BSA濃度梯度的吸光值作圖，獲得對(duì)數(shù)曲線斜率絕對(duì)值。

1.3.3.3 競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度測(cè)定

分別取10、20、30、40、50、60 μL樣品提取液到2 mL離心管中，氮?dú)獯蹈珊蠹? mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液，渦旋10 s，將單寧酸-樣品加樣體積溶液梯度分別與0.8 mg/mL 1 mL BSA溶液混合，渦旋10 s，按1.3.3.1中步驟得到吸光值。1 mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液與1 mL 0.8 mg/mL的BSA溶液反應(yīng)后的吸光值為0.642，理論競(jìng)爭(zhēng)體系吸光值為0.642與純樣品加樣體積吸光值之和。在BSA-單寧酸-樣品提取液競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系中，單寧酸和樣品提取液都能夠與BSA結(jié)合，但二者與BSA結(jié)合能力可能存在差異，因此可能會(huì)出現(xiàn)爭(zhēng)奪BSA上結(jié)合位點(diǎn)的現(xiàn)象，這種爭(zhēng)奪能力的強(qiáng)弱可用樣品競(jìng)爭(zhēng)力表示。樣品競(jìng)爭(zhēng)力的計(jì)算如公式(1)所示：

樣品競(jìng)爭(zhēng)力(紫外-可見(jiàn)分光光度法)

(1)

1.3.4 HPLC法-核桃澀味定量評(píng)定

1.3.4.1 色譜條件

優(yōu)先在214 nm下測(cè)量；使用Zorbax 300SB-C18(9.4 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以溶液A[0.1%的三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)超純水溶液]和溶液B(0.1%的TFA乙腈溶液)為流動(dòng)相，梯度洗脫。洗脫程序如下：0～6 min，70%降至50%的A相，30%升至50%的B相；6～9 min，50%升至70%的A相，50%降至30%的B相；9～12 min，保持70%的A相，30%的B相。采集時(shí)間為12 min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4.2 非競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度測(cè)定

用醋酸緩沖液將BSA母液稀釋得到質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的BSA反應(yīng)液，分別取10、20、30、40、50、60 μL樣品提取液，將樣品加樣體積梯度與1 mL 0.8 mg/mL的BSA溶液混合，渦旋10 s，在37 ℃條件下水浴2 h，取出后以轉(zhuǎn)速12 000×g離心10 min。離心后的上清液過(guò)膜裝瓶，上機(jī)測(cè)BSA峰面積。峰面積下降率的計(jì)算如公式(2)所示：

峰面積下降率/%

(2)

1.3.4.3 競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度測(cè)定

分別取10、20、30、40、50、60 μL樣品提取液到2 mL離心管中，氮?dú)獯蹈珊蠹? mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液，渦旋10 s，將單寧酸-樣品加樣體積溶液梯度分別與1 mg/mL 1 mL BSA溶液混合，按1.3.4.2步驟上機(jī)測(cè)BSA峰面積。1 mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液與1 mL 1 mg/mL的BSA溶液反應(yīng)后的峰面積為2 260.23，即理論峰面積，樣品競(jìng)爭(zhēng)力的計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進(jìn)行初步處理，圖表采用Microsoft Excel 2016繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見(jiàn)分光光度法在樣品澀味程度定量評(píng)定中的應(yīng)用

2.1.1 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

單寧酸濃度梯度與BSA濃度梯度反應(yīng)后，吸光值如表2所示。固定單寧酸質(zhì)量濃度，隨著B(niǎo)SA質(zhì)量濃度的增大，吸光值呈減小趨勢(shì)，反應(yīng)液中剩余單寧酸含量也呈減小趨勢(shì)。但是，當(dāng)BSA質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL，單寧酸質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4 mg/mL以及BSA質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL，單寧酸質(zhì)量濃度為0.1、0.2 mg/mL時(shí)，吸光值會(huì)驟然升高，從而出現(xiàn)“翹尾”現(xiàn)象。固定單寧酸濃度，用該濃度下的BSA濃度梯度的吸光值作對(duì)數(shù)曲線(除去“翹尾點(diǎn)”)，得到其斜率絕對(duì)值。再用單寧酸濃度梯度與對(duì)應(yīng)的斜率絕對(duì)值作圖，得到線性方程：y=0.473 7x+0.011 4，兩者的相關(guān)性R2達(dá)到0.999 6，表明它們呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。由此可知，對(duì)數(shù)曲線斜率的絕對(duì)值可以反映單寧酸與BSA的結(jié)合能力，即斜率絕對(duì)值越大，單寧酸濃度越高，則相對(duì)應(yīng)的澀味就越強(qiáng)。因此，可以用對(duì)數(shù)曲線的斜率絕對(duì)值衡量樣品的澀味程度相對(duì)強(qiáng)弱。

表2 單寧酸、BSA溶液梯度混合吸光值測(cè)定Table 2 The absorbance values of the reaction systems containing different concentrations of tannins and BSA

2.1.2 非競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度定量評(píng)定

如圖1所示，隨著樣品加樣體積的增加，G1、Z1對(duì)數(shù)曲線斜率的絕對(duì)值也逐漸增大，即澀味程度增加(去除“增高點(diǎn)”、“翹尾點(diǎn)”)。但是，D1對(duì)數(shù)曲線斜率的絕對(duì)值在30 μL處得到最低值，隨后又逐漸增大。當(dāng)樣品加樣體積為10、20、30、40 μL時(shí)，所得對(duì)數(shù)曲線斜率的絕對(duì)值與感官評(píng)審結(jié)果不符。只有當(dāng)加樣體積高于50 μL時(shí)，對(duì)數(shù)曲線斜率的絕對(duì)值才表現(xiàn)為G1>Z1>D1，與感官評(píng)審結(jié)果相符。

實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)，加樣體積定為60 μL。隨著B(niǎo)SA質(zhì)量濃度增加，樣品的吸光值均在0.2 mg/mL BSA質(zhì)量濃度處達(dá)到最高值，其中G3和Z2吸光值最高，分別為2.068和2.046。去除“增高”點(diǎn)前的數(shù)據(jù)，得到不同樣品的對(duì)數(shù)曲線斜率絕對(duì)值，如表3所示。其中，感評(píng)審官高澀味程度的G1、G2、G3樣品的斜率絕對(duì)值分別為0.423、0.222、0.461，感官評(píng)審澀味程度的Z1、Z2、Z3樣品的斜率絕對(duì)值分別為0.357、0.373、0.308，感官評(píng)審低澀味程度的D1、D2、D3樣品的斜率絕對(duì)值分別為0.224、0.269、0.141。結(jié)果表明，對(duì)數(shù)曲線斜率的絕對(duì)值僅能大致將樣品分為高、中、低澀味程度三個(gè)區(qū)間，而無(wú)法進(jìn)一步區(qū)分感官評(píng)分相近的樣品。

圖1 紫外-可見(jiàn)分光光度法的非競(jìng)爭(zhēng)體系-樣品加樣體積確定Fig.1 The determination of sample volume in non-competitive system of UV-vis

表3 紫外法的非競(jìng)爭(zhēng)體系-樣品斜率絕對(duì)值Table 3 The absorbance values and the slope of the logarithmic curve of walnut in non-competitive system of UV

2.1.3 競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度定量評(píng)定

在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系中，如圖4所示，隨著加樣體積增多，純樣液梯度、實(shí)際競(jìng)爭(zhēng)體系吸光值、理論競(jìng)爭(zhēng)體系吸光值均呈線性增加，但樣品的競(jìng)爭(zhēng)力并未隨著加樣體積的增加而增加，且二者之間線性關(guān)系不明顯(R2=0.126)。

圖2 紫外-可見(jiàn)分光光度法的競(jìng)爭(zhēng)體系-G1樣品競(jìng)爭(zhēng)力Fig.2 The competitiveness of G1 in competitive system of UV-vis

2.2 HPLC法在樣品澀味程度定量評(píng)定中的應(yīng)用

2.2.1 非競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度定量評(píng)定

如圖3所示，同一樣品中，峰面積下降率隨著加樣體積的增加而增加，但二者之間不呈線性。當(dāng)G1、Z1的加樣體積為30 μL時(shí)，峰面積下降率均為50%左右，隨著加樣體積增多，其峰面積下降率逐漸趨于飽和(100%)；而對(duì)D1而言，加樣體積為60 μL時(shí)，峰面積下降率僅為44.28%。此外，在各加樣體積下，樣品峰面積下降率與感官評(píng)審結(jié)果不相符(30 μL除外)。結(jié)果表明，非競(jìng)爭(zhēng)體系中，由于HPLC法靈敏度較高，很難確定不同樣品的加樣體積；加樣體積梯度與峰面積下降率之間不呈線性增加，無(wú)法擬合線性方程。

圖3 HPLC法的非競(jìng)爭(zhēng)體系-樣品加樣體積確定Fig.3 The determination of sample volume in non-competitive system of HPLC

2.2.1 競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品澀味程度定量評(píng)定

經(jīng)計(jì)算，樣品加樣體積梯度和樣品競(jìng)爭(zhēng)力之間呈線性關(guān)系，進(jìn)而根據(jù)樣品加樣體積梯度與其所對(duì)應(yīng)的峰面積下降率進(jìn)行線性擬合，得到線性方程，G1、Z1、D1樣品的分別為y=0.001 8x+0.021 7、y=0.001 6x+0.002、y=0.001 3x-0.032 2，R2分別為0.993、0.994、0.981。再根據(jù)線性方程計(jì)算50%峰面積下降率所需樣品加樣體積(IC50)，IC50值越大，樣品澀味程度越弱。G1、Z1、D1其IC50值分別為274.57、302.47，406.55。結(jié)果表明，采用HPLC法-競(jìng)爭(zhēng)體系能夠?qū)⒏泄僭u(píng)審區(qū)別較大的樣品區(qū)分開(kāi)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此法的可行性，對(duì)已有的9個(gè)樣品進(jìn)行了澀味程度評(píng)定，如表4所示，發(fā)現(xiàn)感官評(píng)分越低，樣品IC50值越大。

表4 HPLC法的競(jìng)爭(zhēng)體系中樣品的IC50值Table 4 The IC50values of walnut samples in competitive system of HPLC

3 討論

3.1 紫外-可見(jiàn)分光光度法-非競(jìng)爭(zhēng)體系在固態(tài)核桃樣品中的適應(yīng)性

已有研究表明，固定單寧酸質(zhì)量濃度，隨著B(niǎo)SA質(zhì)量溶液濃度升高，BSA-單寧酸結(jié)合反應(yīng)生成的沉淀量也逐漸增加[19]，同時(shí)吸光值降低。本研究中，測(cè)定單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，當(dāng)單寧酸質(zhì)量濃度較低時(shí)，會(huì)在BSA溶液質(zhì)量濃度較高點(diǎn)出現(xiàn)吸光值驟然升高的“翹尾”現(xiàn)象。一般而言，蛋白質(zhì)和單寧酸可以通過(guò)氫鍵、疏水作用力和分子間作用力等相互結(jié)合，二者最初結(jié)合會(huì)形成可溶性的聚集物，而較高質(zhì)量濃度的單寧酸會(huì)促使這些可溶性聚集物進(jìn)一步結(jié)合形成沉淀，要形成最大沉淀量，單寧酸/BSA兩者需達(dá)到最佳比例[20]。而當(dāng)BSA質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)可能會(huì)由于暴露在單寧酸中變性，致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[21]，從而對(duì)紫外分光光度計(jì)所測(cè)結(jié)果造成干擾，造成“翹尾”現(xiàn)象。

在核桃樣品的澀味定量評(píng)定時(shí)，無(wú)論樣品加樣體積多少，隨著B(niǎo)SA質(zhì)量濃度增加，吸光值會(huì)在0.2 mg/mL BSA質(zhì)量濃度處先達(dá)到一個(gè)最高值，隨后再逐漸下降。此現(xiàn)象可能與提取液中溶劑殘留物質(zhì)有關(guān)系。早有學(xué)者利用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)葡萄酒的澀味進(jìn)行評(píng)定，其澀味程度評(píng)定結(jié)果與感官評(píng)審結(jié)果基本一致，相關(guān)性高達(dá)0.91[17]。葡萄酒本身作為一種混合均勻的溶液，無(wú)論是感官評(píng)審還是儀器評(píng)定澀味，都具有優(yōu)勢(shì)。本研究中的樣品均為固體，非競(jìng)爭(zhēng)體系僅能將核桃樣品按澀味程度大致分為高、中、低三類，而無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)定澀味感官評(píng)分相近的樣品。由此可見(jiàn)，紫外-可見(jiàn)分光光度雖然能夠克服主觀因素、個(gè)體差異、感官疲勞等影響因素，并對(duì)核桃樣品澀味程度進(jìn)行大致定量評(píng)定。但是在進(jìn)行大批核桃樣品澀味的定量評(píng)價(jià)時(shí)，此法仍存在穩(wěn)定性差、受外界影響較大等缺陷。

3.2 HPLC法-非競(jìng)爭(zhēng)體系在固態(tài)核桃樣品中的適應(yīng)性

HPLC法能夠定量的反映出蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)的結(jié)合能力，但現(xiàn)有研究多集中于唾液蛋白與單體酚(兒茶素、表兒茶素等)之間的反應(yīng)[22-23]，并未將其用至實(shí)際樣品的澀味程度定量評(píng)定中。因此，本研究選擇固定BSA質(zhì)量濃度，加入不同體積樣品進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同樣品對(duì)應(yīng)的BSA峰面積下降率與加樣體積間不呈線性關(guān)系，并且不同品種核桃的BSA峰面積下降率達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)加樣體積差距較大。事實(shí)上，與純單寧酸溶液不同，核桃樣品提取液是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的混合酚體系，不同品種會(huì)造成酚類物質(zhì)含量及種類差異[10]。而這個(gè)混合樣品體系中的某2種，甚至多種酚之間可能存在協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)了與蛋白的相互作用，促使形成更高的不溶性聚集物[24]，從而出現(xiàn)峰面積下降率“驟變”點(diǎn)。此外，蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)間相互作用的締合強(qiáng)度還會(huì)隨著酚結(jié)構(gòu)的變化而變化[25]。正是不同核桃品種間的差異，會(huì)使得峰面積下降率的“驟變點(diǎn)”大不相同，在實(shí)際操作過(guò)程中不同品種核桃加樣體積的確定也更為困難。因此，HPLC法-非競(jìng)爭(zhēng)體系無(wú)法準(zhǔn)確且定量評(píng)定核桃樣品的澀味程度。

3.3 紫外-可見(jiàn)分光光度和HPLC法的競(jìng)爭(zhēng)體系在固態(tài)核桃樣品中的適應(yīng)性比較

多酚類物質(zhì)與蛋白結(jié)合產(chǎn)生澀感的屬性十分復(fù)雜，不僅易受到自身化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量的影響，還與二者結(jié)合時(shí)外部環(huán)境條件(溫度、pH等因素)密切相關(guān)[25]。因此，紫外法和HPLC法的非競(jìng)爭(zhēng)體系均難以準(zhǔn)確測(cè)定核桃樣品的澀味程度，且HPLC法難以確定樣品的加樣體積。因此，本實(shí)驗(yàn)采用BSA-單寧酸-樣品提取液競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系對(duì)樣品的澀味程度進(jìn)行評(píng)定。

在競(jìng)爭(zhēng)體系中，理論上隨著樣品加樣體積增加，樣品的競(jìng)爭(zhēng)力也應(yīng)增強(qiáng)。但在紫外-可見(jiàn)分光光度法中樣品的競(jìng)爭(zhēng)力并未隨著加樣體積的增加而增加。因此，用紫外光度計(jì)法不能區(qū)分競(jìng)爭(zhēng)體系中不同澀味程度的樣品。用HPLC法時(shí)，對(duì)核桃樣品感官評(píng)分和IC50值進(jìn)行線性擬合，如圖4所示，得到線性方程：y=-20.089x+357.49，R2=0.935 2。因此，可利用IC50值表示核桃澀味程度，IC50值越大，樣品澀味程度越大。結(jié)果表明，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系，能夠放大BSA與樣品中酚類物質(zhì)的結(jié)合程度，使得峰面積下降率“驟變”現(xiàn)象消失，從而能消除因品種間酚類物質(zhì)含量、種類不同造成的澀味定量評(píng)定結(jié)果偏差。

圖4 HPLC法的競(jìng)爭(zhēng)體系中感官評(píng)分與IC50值的關(guān)系Fig.4 The linear relationship between sensory astringency score of walnut and IC50in competitive system of HPLC

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外法、HPLC法對(duì)不同澀味程度的固態(tài)核桃樣品進(jìn)行了澀味定量評(píng)定。在非競(jìng)爭(zhēng)體系中，紫外法在測(cè)定中會(huì)出現(xiàn)吸光值“增高點(diǎn)”和“翹尾點(diǎn)”等現(xiàn)象，并僅能根據(jù)定量評(píng)定結(jié)果將其大致分為高、中、低三類，無(wú)法進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行詳細(xì)、準(zhǔn)確的定量評(píng)定；HPLC法在測(cè)定中會(huì)出現(xiàn)BSA峰面積下降率飽和的現(xiàn)象，大批樣品測(cè)定時(shí)很難確定具體的加樣體積，因此增加了樣品澀味定量評(píng)定的難度，降低了評(píng)定的準(zhǔn)確度。而在競(jìng)爭(zhēng)體系中，紫外法中樣品的競(jìng)爭(zhēng)力與加樣體積之間不呈線性，因此不適宜用于澀味程度的評(píng)定；HPLC法測(cè)定時(shí)，樣品的競(jìng)爭(zhēng)力與加樣體積間不僅呈線性，而且樣品感官評(píng)分和IC50值呈良好線性(R2=0.935 2)，即IC50值越大，樣品澀味程度越大。因此，在HPLC法的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系能夠克服吸光值“增高點(diǎn)”、“翹尾點(diǎn)”、峰面積下降率驟然飽和等現(xiàn)象，可用于大批量的對(duì)核桃樣品的澀味定量評(píng)定。