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    低聚原花青素通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用研究*

    2022-12-17 08:07:54高利超甘林望耿磊劉建吳蔚樺歐三桃
    關(guān)鍵詞:劑量血糖檢測

    高利超,甘林望,耿磊,劉建,吳蔚樺,歐三桃

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腎病內(nèi)科,四川 瀘州 646000)

    隨著我國生活水平提高,糖尿病發(fā)病率越來越高。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥,DN 最終可發(fā)展為終末期腎病,導(dǎo)致不良預(yù)后[1-2]。積極防治DN,抑制病情進展,是避免腎衰竭,延長患者生命的主要手段。氧化應(yīng)激是DN 致病機制中的重要部分,低聚原花青素是天然的抗氧化劑,具有降糖降脂、調(diào)節(jié)免疫的作用。劉尚軍等[3]研究表明,原花青素能有效減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎纖維化程度,發(fā)揮腎保護功效。

    近年來研究證實,Wnt 信號通路參與急性腎損傷、腎臟腫瘤等多種腎臟病變,并通過調(diào)節(jié)腎小球固有細胞的增殖與凋亡,參與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展,與DN 也存在密切聯(lián)系[4-6]。為研究低聚原花青素治療DN 的具體作用機制,探究其是否能通過Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮腎臟保護功效,西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院開展如下研究。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    60 只SD 雄性大鼠購自上海海利生物技術(shù)股份有限公司,體重300~320 g。大鼠自由飲食、飲水,在25℃、濕度50%的環(huán)境中喂養(yǎng),12 h 晝/夜循環(huán)照明。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2021-0005,實驗動物使用許可證號:SYXK(川)2021-0014。

    1.2 主要試劑與儀器

    低聚原花青素(西安通澤生物科技有限公司),鏈脲佐菌素(美國Sigma公司),SOD、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),SABC 免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),兔抗鼠Wnt4多克隆抗體、兔抗鼠β-catenin 多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),TRIzol 試劑(上海生工生物工程股份有限公司),光學(xué)顯微鏡及全自動生化分析儀(日本Olympus 公司),One Touch Ⅱ型血糖儀(美國強生公司),PCR擴增儀(杭州領(lǐng)航基因科技有限公司),-80℃冰箱(美國Thermo Scientific forma公司),低溫高速離心機(美國Bckman公司)。

    1.3 分組及處理

    1.3.1 實驗分組選擇60 只SD 雄性大鼠隨機分為正常對照組(NC 組)、DN 模型組(DN 組)、DN 模型+低劑量低聚原花青素組(低劑量組)、DN 模型+中劑量低聚原花青素組(中劑量組)、DN 模型+高劑量低聚原花青素組(高劑量組),每組12只。

    1.3.2 處理方法①采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素復(fù)制DN 模型,具體操作:將鏈脲佐菌素溶解于pH 4.5 檸檬酸鈉,按照55 mg/kg 的比例,腹腔注射復(fù)制DN 模型。24 h 后采集大鼠尾靜脈血,血糖儀監(jiān)測血糖,若血糖>16.7 mmol/L則模型復(fù)制成功。②模型復(fù)制成功后,低、中、高劑量組分別給予50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 低聚原花青素灌胃,NC 組和DN 組給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃16 周。

    1.4 留取標本

    分別于實驗4周、8周、12周、16周末收集大鼠24 h尿量,檢測24 h尿蛋白定量。16周末大鼠行腹腔麻醉,取4 mL血液,用于檢測血糖、血清肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)。

    固定大鼠,打開胸腔,充分暴露心臟,將注射器插入左心室,連接輸液器,使PBS 溶液順利進入心臟,用眼科剪在右心耳處剪一個小口,使血液流出,持續(xù)輸入PBS液,待腎臟變白后取出左腎,去除包膜,用濾紙擦拭干,稱取重量,計算腎重指數(shù)(腎臟重量/體重),取出部分腎組織,按照組織塊重量與預(yù)冷勻漿體積比1∶9,冰水浴制成10%組織勻漿,2 000 r/min 離心15min,收集上清液用于檢測腎組織內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。取出部分腎臟組織固定于10% 甲醛,待行病理檢查、Westernblotting及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。

    1.5 指標檢測

    1.5.1 24 h 尿蛋白定量采用雙縮脲法檢測24 h尿蛋白定量。

    1.5.2 血糖、Scr、BUN水平采用全自動生化分析儀檢測血糖、Scr、BUN 水平。

    1.5.3 腎組織SOD活性及MDA含量采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性,硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

    1.5.4 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)及過碘酸希夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色觀察腎組織病理形態(tài)①用10%中性甲醛固定大鼠腎臟組織24 h,將腎組織修剪為2 mm厚的組織塊,乙醇脫水,二甲苯透明處理,浸泡后石蠟包埋。②HE 染色:脫蠟至水,經(jīng)二甲苯處理30 min,100%乙醇、95%乙醇分別處理5 min,蘇木精液染色10 min,1%鹽酸乙醇處理4 s,1%氨水返藍,伊紅染色3 min,顯微鏡下觀察。③PAS 染色:梯度乙醇脫蠟至水,高碘酸氧化液室溫處理20 min,無色品紅染色15 min,蘇木精染細胞核15 min,1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,95%乙醇、100%乙醇分別脫水5 min,二甲苯3 次透明。

    1.5.5 Western blotting 檢測腎組織Wnt4、β-catenin蛋白的表達取部分腎組織,采用玻璃勻漿器制備組織勻漿,通過SDS-PAGE 凝膠電泳對其進行分離,分別加入50 μL 兔抗鼠Wnt4 多克隆抗體(1∶200)、β-catenin 多克隆抗體(1∶100),采用ELC 增強型發(fā)光液檢測Wnt4、β-catenin 蛋白的表達,以β-actin 為內(nèi)參,計算各組蛋白相對表達量。

    1.5.6 qRT-PCR 檢測腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 的表達①提取總RNA:取實驗大鼠腎組織,加入Trizol 試劑,提取總RNA,取5 μL RNA 溶液,稀釋100倍,用紫外分光光度計檢測各樣品OD值,按照1 個OD260 值相當于40 μg/mL RNA 計算RNA 濃度,總RNA 濃度=OD260 值×40 μg/mL×100,RNA 純度以A260/280 表示,其值在1.8~2.2 為純度符合要求。②RNA 逆轉(zhuǎn)錄:逆轉(zhuǎn)錄體系在冰上完成,取10 μL RNA,隨機引物(0.2 μg/mL)1 μl,加去DEPC 水至12 μL,均勻后離心3 s,65℃孵育5 min,冷卻30 s,加入5×Buffer 4 μL,3 μL dNTP(10 mmol/L),1 μL RNA 酶抑制劑(20 u/μL),1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶(20 u/μL),最后體積為20 μL,混勻離心,25℃孵育10 min,42℃孵育1 h,72℃孵育15 min。③qRT-PCR:以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 為模板,在聚合酶催化下進行PCR擴增,引物設(shè)計及合成均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成,引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系共20 μL,包括FastStat universsl SYYBR green master 10 μL,正反向引物各0.5 μL,CDNA 溶液2.0 μL,DNase/Rnase free ddH2O 7.0 μL。④擴增條件:94℃預(yù)變性10 min,94℃變性15 s,60℃延伸1 min,共45 個循環(huán)。⑤采用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠血糖、Scr、BUN比較

    各組大鼠血糖、Scr 及BUN 水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步兩兩比較結(jié)果:DN 組血糖、Scr、BUN 水平較NC 組升高(P<0.05);低、中、高劑量組血糖、Scr、BUN水平較DN 組下降(P<0.05)。見表1。

    表2 各組大鼠血糖、Scr、BUN比較(n=12,)

    表2 各組大鼠血糖、Scr、BUN比較(n=12,)

    注:①與NC組比較,P <0.05;②與DN組比較,P <0.05。

    2.2 各組大鼠不同時間點24 h尿蛋白定量的變化

    各組大鼠灌胃4 周、8 周、12 周、16 周的24 h尿蛋白定量比較,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點24 h 尿蛋白定量有差異(F=102.38,P=0.000)。②各組24 h 尿蛋白定量有差異(F=86.58,P=0.000)。③各組24 h 尿蛋白定量變化趨勢有差異(F=174.64,P=0.000)。見表3。

    表3 各組大鼠不同時間點24 h尿蛋白定量比較(n=12,mg/24 h,)

    表3 各組大鼠不同時間點24 h尿蛋白定量比較(n=12,mg/24 h,)

    2.3 各組大鼠腎組織病理變化

    腎切片HE 染色和PAS 染色光鏡檢查結(jié)果顯示,NC 組可見正常腎小球及腎小管,腎小管上皮細胞排列整齊。DN 組大鼠腎組織部分腎小管萎縮、小管間質(zhì)區(qū)基質(zhì)增加,間質(zhì)內(nèi)見大量炎癥細胞浸潤,腎間質(zhì)纖維化、部分腎小管上皮細胞空泡變性、脫落。低、中、高劑量組以上病理改變均較DN 組減弱,且各劑量組呈劑量依賴性減弱。見圖1。

    圖1 各組大鼠腎組織病理改變(×200)

    2.4 各組大鼠左腎指數(shù)比較

    NC 組、DN 組及低、中、高劑量組左腎指數(shù)分別 為(0.22±0.07)、(0.46±0.11)、(0.37±0.09)、(0.33±0.07)、(0.29±0.06),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.605,P=0.000)。進一步兩兩比較結(jié)果:DN 組左腎指數(shù)較NC 組升高(P<0.05);低、中、高劑量組左腎指數(shù)較DN 組降低(P<0.05)。

    2.5 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量比較

    各組大鼠SOD 活性比較,經(jīng)方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠MDA 含量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步兩兩比較結(jié)果:與NC 組比較,DN 組MDA 含量升高(P<0.05),與DN 組比較,不同劑量組MDA 含量降低(P<0.05)。見表4。

    表4 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量比較(n=12,)

    表4 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量比較(n=12,)

    注:①與NC組比較,P <0.05;②與DN組比較,P <0.05。

    2.6 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白表達

    各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步兩兩比較結(jié)果:DN 組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達量高于NC 組(P<0.05),不同劑量組Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達量低于DN 組(P<0.05)。見 表5 和圖2。

    表5 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA和蛋白相對表達量比較(n=12,)

    表5 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA和蛋白相對表達量比較(n=12,)

    注:①與NC組比較,P <0.05;②與DN組比較,P <0.05。

    圖2 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin蛋白的表達

    3 討論

    腎臟是糖尿病最常累及的器官,DN 最終將發(fā)展為終末期腎病,影響患者預(yù)后。低聚原花青素是一種天然抗氧化劑,清除體內(nèi)自由基的效能遠高于維生素C 及維生素E[7-9]。有研究結(jié)果表明,原花青素能有效清除機體自由基,減輕心肌缺血再灌注損傷,同時還能抗動脈粥樣硬化[8,10]。為研究低聚原花青素治療DN 的作用,本研究通過復(fù)制鏈脲佐菌素模型DN 大鼠模型,并分別以50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 低聚原花青素對DN 大鼠進行灌胃處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC 組比較,DN 組大鼠血糖、Scr、BUN 水平顯著上升,而經(jīng)不同劑量低聚原花青素干預(yù)后,以上指標水平均有所下降,且下降趨勢呈劑量依賴性。本研究中各組大鼠不同時間點24 h 尿蛋白定量結(jié)果表明,NC 組各時間點24 h尿蛋白定量無明顯變化,而DN 組大鼠24 h 尿蛋白定量隨時間的推移呈上升趨勢,且各時間點尿蛋白定量水平均明顯高于NC 組。但經(jīng)各劑量低聚原花青素干預(yù)后,DN 模型大鼠各時間點尿蛋白定量均明顯下降,且下降幅度呈劑量依賴性。

    DN最主要的病理改變有腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等,本實驗中大鼠腎組織切片染色結(jié)果提示,DN 組大鼠腎組織內(nèi)腎小管萎縮、小管間質(zhì)區(qū)基質(zhì)增生、纖維化等改變明顯。而經(jīng)不同劑量低聚原花青素處理后的大鼠腎組織以上改變均減輕,且減輕程度呈劑量依賴性。檢測各組大鼠左腎指數(shù)也發(fā)現(xiàn),DN 組腎指數(shù)明顯升高,提示大鼠腎組織組成成分發(fā)生了改變,而經(jīng)不同劑量低聚原花青素處理后,大鼠左腎指數(shù)有所下降,且下降程度呈劑量依賴性。以上研究結(jié)果表明,經(jīng)低聚原花青素處理后,DN大鼠腎組織纖維化、腎小管硬化等病理改變減輕,24 h尿蛋白定量異常在一定程度上得到糾正,說明低聚原花青素能有效改善大鼠DN腎臟結(jié)構(gòu)和臨床表現(xiàn)。

    SOD 是一類含有金屬的氧化還原酶,能催化超氧化物,其活性與機體自由氧清除能力呈正相關(guān),是機體最重要的細胞防御系統(tǒng)[11-13]。MDA 是組織細胞膜脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一,能有效反映組織內(nèi)抗氧化能力[14-15]。本研究檢測各組大鼠腎臟組織勻漿上清液SOD 活性及MDA 含量發(fā)現(xiàn),DN 組SOD 活性明顯降低,MDA 含量明顯上升,提示DN大鼠腎臟組織的抗氧化及自由基清除能力減弱。但經(jīng)不同濃度低聚原花青素處理后,大鼠SOD 活性增強,MDA 含量下降,說明低聚原花青素能有效增強自由基清除能力,發(fā)揮抗氧化功能。

    DN 的致病機制復(fù)雜,除氧化應(yīng)激外,Wnt 信號通路也可能通過調(diào)節(jié)腎小球固有細胞的增殖與凋亡,參與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展[16-19]。本研究結(jié)果也表明,DN 大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達量較NC 組明顯升高,提示DN 大鼠腎組織內(nèi)Wnt4/β-catenin 信號通路被激活,而經(jīng)不同濃度低聚原花青素干預(yù)后,大鼠腎組織Wnt4、βcatenin mRNA 和蛋白相對表達量降低,提示低聚原花青素可能通過抑制Wnt4/β-catenin 信號通路,抑制DN 病情發(fā)展,減輕腎組織病理改變。

    綜上所述,低聚原花青素能有效降低DN 大鼠24 h 尿蛋白定量,減輕腎臟病理損害。低聚原花青素可能通過抗氧化作用及抑制Wnt4/β-catenin 信號通路,發(fā)揮腎臟保護功效,并有望成為DN 的治療藥物。

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