MicroRNA-206、microRNA-29b、microRNA-133a的表達(dá)及對(duì)骨折患者延遲愈合的預(yù)測(cè)價(jià)值*

彭洋，向桃，唐玉琦，趙冬雪，艾巧玲，程明

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 骨科，四川 成都 610072；2.成都市金牛區(qū)人民醫(yī)院 康復(fù)科，四川 成都 610036）

由炎癥、創(chuàng)傷、腫瘤切除等多種因素誘發(fā)的節(jié)段性骨缺損是臨床面臨的重要難題之一。有研究指出，骨組織不愈合、延遲愈合等均可能造成長(zhǎng)期疼痛，降低患者生活質(zhì)量，并因反復(fù)手術(shù)而增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。此外，有研究指出，骨折愈合延遲可能給患者造成嚴(yán)重不良影響，甚至可能導(dǎo)致患者死亡，因此臨床選擇合理有效的治療手段對(duì)患者進(jìn)行干預(yù)，提高患者骨組織修復(fù)速度和治療效果是重要的治療策略之一[2]。近年來，臨床上骨折的治療包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子等生物療法，以及低強(qiáng)度和磁場(chǎng)脈沖超聲等物理療法。有研究指出，雖然上述方法可有效促進(jìn)骨組織修復(fù)，但是臨床療效均不滿意[3]。

MicroRNA（miRNA）是機(jī)體重要的可有效調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA，在肌肉、軟骨和骨組織發(fā)育及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，在骨組織修復(fù)過程中扮演重要角色，可作為潛在的評(píng)估和預(yù)測(cè)骨折愈合狀態(tài)的重要指標(biāo)[4]。MicroRNA-206（miR-206）、microRNA-29b（miR-29b）、microRNA-133a（miR-133a）是骨發(fā)育和塑形的生物標(biāo)志物，參與體內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的活性調(diào)節(jié)，在骨代謝的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。但在骨折患者延遲愈合的評(píng)估中miR-206、miR-29b、miR-133a 扮演何種作用仍鮮有報(bào)道。本研究選取四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院收治的123例骨折延遲愈合患者作為研究對(duì)象，分析miR-206、miR-29b、miR-133a 的表達(dá)及對(duì)骨折患者延遲愈合的預(yù)測(cè)價(jià)值，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月—2020 年12 月四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院收治的骨折延遲愈合患者123例作為觀察組，另取同期本院100例骨折愈合正常患者作為對(duì)照組，均為股骨干閉合性粉碎性骨折。

觀察組男性79例，女性44例；年齡（49.82±7.31）歲；病程（14.39±4.12）月；Winquist 分型：Ⅰ型21例，Ⅱ型24例，Ⅲ型29例，Ⅳ型49例；手術(shù)方式：切開復(fù)位動(dòng)力加壓鋼板螺釘內(nèi)固定術(shù)57例，切開復(fù)位帶鎖髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)66例。對(duì)照組男性65例，女 性35例；年 齡（50.19±8.13）歲；病 程（13.97±3.91）月；Winquist 分型：Ⅰ型18例，Ⅱ型20例，Ⅲ型21例，Ⅳ型41例；手術(shù)方式：切開復(fù)位動(dòng)力加壓鋼板螺釘內(nèi)固定術(shù)48例，切開復(fù)位帶鎖髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)52例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審議并批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)①年齡≥18 周歲；②首次接受手術(shù)治療的骨折患者；③骨折損傷后≥3 個(gè)月無明顯愈合傾向；④骨折延遲愈合相關(guān)指征符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；⑤X 射線掃描見骨痂完全不生長(zhǎng)或極少生長(zhǎng)；⑥斷端骨質(zhì)出現(xiàn)間隙或硬化。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①合并嚴(yán)重心腦血管疾?。虎诤喜⒊霈F(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾?。虎酆喜⒐谴x疾病或糖尿?。虎芨?、腎等臟器功能出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷；⑤入組前3 個(gè)月有激素服用史；⑥臨床或隨訪治療缺失。

1.3 主要試劑及儀器

RNA 抽提試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司），引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，離心機(jī)（美國(guó)Backman 公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 qRT-PCR 檢測(cè)血清miR-206、miR-29b、miR-133a的表達(dá)

術(shù)后6 周采集患者空腹靜脈血5 mL，離心收集血清。用RNA 抽提試劑盒提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR 儀檢測(cè)血清miR-206、miR-29b、miR-133a。反應(yīng)體系共10 μL：正反向引物各0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.4 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以U6為內(nèi)參，按照2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線，分析miR-206、miR-29b、miR-133a 單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-206、miR-29b、miR-133 相對(duì)表達(dá)量比較

兩組血清miR-206、miR-29b、miR-133 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組均高于對(duì)照組。見表2。

表2 兩組血清miR-206、miR-29b、miR-133相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2 兩組血清miR-206、miR-29b、miR-133相對(duì)表達(dá)量比較（）

2.2 miR-206、miR-29b、miR-133a 預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的準(zhǔn)確性

ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-206、miR-29b、miR-133a 的截?cái)嘀捣謩e為0.36、0.61、0.63，高于此截?cái)嘀祫t預(yù)測(cè)患者骨折延遲愈合。miR-206、miR-29b、miR-133a 預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的準(zhǔn)確性分別為82.79%、83.90%和86.67%，3 者聯(lián)合預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的準(zhǔn)確性為96.72%，高于單獨(dú)預(yù)測(cè)。見表3。

表3 miR-206、miR-29b、miR-133a預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的結(jié)果比較

2.3 miR-206、miR-29b、miR-133a 預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的價(jià)值

ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-206、miR-29b、miR-133a 聯(lián)合預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的敏感性和特異性分別為95.94%（95%CI：0.922，0.986）、96.00%（95%CI：0.937，0.993）高于單獨(dú)預(yù)測(cè)。其中，miR-206 敏感性為82.11%（95% CI：0.766，0.881），特異性為79.00%（95% CI：0.742，0.841）；miR-29b 敏感性為80.49%（95% CI：0.776，0.887），特異性為81.00%（95% CI：0.784，0.845）；miR-133a 敏感性為84.55%（95% CI：0.774，0.892），特異性為84.00%（95% CI：0.808，0.890）。見表4 和圖1。

表4 miR-206、miR-29b、miR-133a預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的參數(shù)

圖1 miR-206、miR-29b、miR-133a及3者聯(lián)合預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的ROC曲線

3 討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，骨折發(fā)生率也呈逐漸升高的趨勢(shì)[5]。多數(shù)患者治療后骨折可有效愈合，但仍有部分患者出現(xiàn)愈合延遲，恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，甚至增加二次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳。有研究指出，骨折愈合是體內(nèi)重要的骨骼原始連續(xù)性重建、骨再生，并恢復(fù)骨正常功能和結(jié)構(gòu)的過程[6]。有學(xué)者指出，骨折延遲愈合過程中有多種因子相互作用[7]。

miRNA 可有效調(diào)控機(jī)體內(nèi)大量基因表達(dá)，并參與細(xì)胞分化、增殖、組織器官形成、胚胎發(fā)育等多種生理過程。骨折修復(fù)愈合的動(dòng)態(tài)過程包括原始骨痂形成、血腫機(jī)化、骨痂改造塑形等多個(gè)階段，而miRNA 在該過程中出現(xiàn)顯著變化。有研究指出，與健康人群比較，絕經(jīng)后婦女低骨密度椎體骨折患者體內(nèi)miR-2861、miR-124 明顯升高，miR-29、miR-23、miR-21 顯著降低[8]。有研究表明，血清miRNA 促進(jìn)新生血管生成、骨缺損修復(fù)[9]。骨折患者多伴隨血管損傷，并出現(xiàn)缺氧、缺血，對(duì)干細(xì)胞及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸造成一定影響。有學(xué)者指出，骨折患者在支架材料植入初始階段常發(fā)生細(xì)胞死亡，最終可能誘發(fā)延遲愈合甚至修復(fù)失敗[10]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-206、miR-29b、miR-133a 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組。miR-206、miR-29b、miR-133a 聯(lián)合預(yù)測(cè)骨折延遲愈合的敏感性、特異性明顯高于單獨(dú)檢測(cè)。有研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌miR-206 特異性表達(dá)會(huì)有效抑制成骨細(xì)胞分化，當(dāng)該基因被敲除后則可有效促進(jìn)成骨分化[11]。miR-29b 是調(diào)控新生血管功能和結(jié)構(gòu)的重要生物活性因子。有研究發(fā)現(xiàn)miR-29b 可靶向調(diào)控Akt3，降低體內(nèi)VEGF 水平，對(duì)血管生成進(jìn)行負(fù)向調(diào)控[12]。而在成骨細(xì)胞分化和成熟過程中，miR-29b 還參與骨基質(zhì)和骨膠原的合成與分泌，進(jìn)而對(duì)骨形成進(jìn)行調(diào)控。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-29b 能效調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化，在骨折愈合過程中扮演重要角色[13]。miR-133 是近年來受到人們廣泛關(guān)注的參與肌肉和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控活性因子。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-133 在骨代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[14]。miR-133 能靶向抑制骨生成，調(diào)控RUNX2 信號(hào)通路并參與骨折愈合過程。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，臨床上可通過檢測(cè)患者血清miR-206、miR-29b、miR-133a 相對(duì)表達(dá)量對(duì)體內(nèi)骨代謝水平進(jìn)行綜合分析，可更全面地反映骨折患者骨代謝、血管功能，從而評(píng)估患者骨折延遲愈合狀態(tài)。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)骨折患者miR-206、miR-29b、miR-133a 相對(duì)表達(dá)量可有效預(yù)測(cè)患者延遲愈合狀態(tài)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。但本研究病例數(shù)較少，且并未對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，有待后續(xù)深入研究和分析。