益生菌對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠腸道菌群和炎癥反應(yīng)的影響*

程友靜，張蕓蕓，廖世霞

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 體檢科，貴州 遵義 563006；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸一科，貴州 遵義 563000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一種慢性進(jìn)展性的肺病理異質(zhì)性疾病，其特征為持續(xù)性氣流阻塞、氣道炎癥增加和肺組織破壞[1]。COPD 的發(fā)病率和病死率較高，已成為世界公共衛(wèi)生問題[2]。目前，COPD 的治療方法有限，主要是肺移植[3]、吸入氫氣[4]、皮質(zhì)類固醇和支氣管擴(kuò)張劑[5]，存在治療成本較高，免疫排斥和部分患者療效欠佳等缺點(diǎn)。因此，尋找新型有效的治療COPD 的藥物已成為臨床亟待解決的問題。

腸道菌群失調(diào)不僅降低胃腸道免疫反應(yīng)，還會(huì)影響肝、肺等遠(yuǎn)端器官的免疫，進(jìn)而危害身體健康。近年來(lái)，大量研究證實(shí)腸道菌群與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，尤其是哮喘、COPD、肺癌和呼吸道感染等[6-8]。此外，亦有學(xué)者指出益生菌治療可調(diào)整慢性乙肝患者腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善肝功能[9]。然而，目前關(guān)于益生菌治療COPD 的研究相對(duì)較少。僅有研究報(bào)道，短雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌可抑制吸煙誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[10]，以及口服補(bǔ)充鼠李糖乳桿菌可減輕COPD 小鼠的肺泡損傷和氣道炎癥[11]。因此，本研究通過煙霧刺激和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）灌胃復(fù)制COPD 大鼠模型，探討益生菌對(duì)COPD 大鼠腸道菌群變化、炎癥反應(yīng)和肺損傷的影響，以期為臨床防治COPD 提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

30 只Wister 雄性大鼠，（80±3）天齡，體重200～250 g，購(gòu)自重慶市陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2021-0003。

Probiotic IMM（美國(guó)Pure Encapsulations 公司，批號(hào)：6030112A），紅旗渠?過濾嘴香煙（河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C0105S、PC188、PT516），Masson 三色染色試劑盒、白細(xì)胞介素8（Interleukin-8，IL-8）ELISA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1340、SEKR-0071），α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α smooth muscle actin,α-SMA）抗體（美國(guó)Cell Signaling 公司，批號(hào)：19245），Alexa Fluor?488 山羊抗大鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）（H+L）、Alexa Fluor?555 山羊抗大鼠IgG（H+L）熒光標(biāo)記二抗和Hoechst 33258（美 國(guó)Thermo Fisher公司，批 號(hào)：A11006、A21434、H3569）。

1.2 動(dòng)物分組和COPD模型的復(fù)制

將30 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、COPD 組和治療組，每組10 只。COPD 組和治療組參考文獻(xiàn)[12]復(fù)制COPD 大鼠模型：第1 天和第14天，大鼠氣道注射200 μL LPS 溶液；第2～13 天和第15～30天，將大鼠置于熏蒸箱并暴露于香煙煙霧中（煙霧濃度約為18%（υ/υ），暴露時(shí)長(zhǎng)為20 min/次，2 次/d，間隔4 h）。對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水，不予熏蒸。

采用等效劑量系數(shù)折算法計(jì)算出益生菌Probiotic IMM 的給藥劑量為0.9 CFU/g/（kg·d）。按此劑量，治療組大鼠灌胃1 次/d，持續(xù)28 d；對(duì)照組和COPD 組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.3 方法

1.3.1 觀察大鼠一般情況每天上午9:00 定時(shí)觀察各組大鼠一般情況，包括飲食量、活動(dòng)表現(xiàn)、氣喘咳嗽癥狀、毛發(fā)光澤度和死亡等。

1.3.2 HE 染色觀察大鼠肺組織病理變化腹腔注射4%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉各組大鼠。75%乙醇消毒后打開大鼠胸腔，剝離出完整的肺。將各組大鼠肺葉組織用4%多聚甲醛緩沖液固定過夜，脫水，石蠟包埋，制成4 μm 厚的切片。加蘇木精和伊紅染色，脫水，風(fēng)干，封片，在光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理變化。

1.3.3 Masson染色觀察大鼠肺組織纖維化改變將載有4 μm 厚組織切片的載玻片置于65℃烘箱中烘干1 h，然后脫蠟。經(jīng)蘇木精和Masson 麗春紅酸性復(fù)合液染色，將玻片放入1%磷鉬酸水溶液中分化3 min，亮綠染色5 min，脫水封片，光鏡下觀察肺組織纖維化改變。

1.3.4 免疫熒光雙染觀察大鼠肺組織α-SMA 的表達(dá)分離獲取大鼠肺組織，加4% 多聚甲醛固定，加0.3% Triton X-100封閉30 min。加入α-SMA 一抗（1∶200 稀釋），4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）清洗5次，加入山羊抗大鼠熒光標(biāo)記二抗混合物（1∶1 000 稀釋），37℃避光反應(yīng)30 min，加入Hoechst 33258 孵育15 min，甘油封閉，在激光共聚焦顯微鏡下觀察α-SMA 的表達(dá)。

1.3.5 ELISA 檢測(cè)血清CRP、IL-8、TNF-α 水平大鼠腹主動(dòng)脈取血，收集血液于采集管中，3 000 r/min離心12 min 得到血清。根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書，將血清樣本加入96 孔板，分別加入抗大鼠CRP、IL-8 和TNF-α，室溫下孵育30 min。PBS 清洗后，依次加過氧化物酶標(biāo)記的生物素化二抗、TMB 和TMB 終止液。最后用酶標(biāo)儀測(cè)量各樣本在450 nm 處的光密度（optical density,OD）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品濃度。

1.3.6 腸道菌群預(yù)配置腸球菌Enter 培養(yǎng)基、腸桿菌EMB 培養(yǎng)基、乳酸桿菌LBS 培養(yǎng)基和雙歧桿菌BS 培養(yǎng)基。收集各組大鼠新鮮糞便（1∶10～1∶1 000 000 000 稀釋），吸取10 μL 標(biāo)本接種于培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度接種3次，并選取合適的稀釋度計(jì)算菌落均值（CFU/g）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

對(duì)照組大鼠飲食正常，動(dòng)作迅捷，反應(yīng)靈敏，皮毛順滑。COPD 組大鼠在模型復(fù)制過程中及模型復(fù)制成功后都出現(xiàn)異常表現(xiàn)，如食欲不振，食量減少，呼吸急促，咳嗽頻繁，毛發(fā)枯黃雜亂，反應(yīng)遲緩等。進(jìn)一步灌胃益生菌，治療組大鼠癥狀有所減輕。其中，COPD 組和治療組在模型復(fù)制過程中各死亡2只、1 只大鼠，對(duì)照組大鼠無(wú)死亡。

2.2 各組大鼠肺組織病理變化

對(duì)照組大鼠細(xì)支氣管管腔結(jié)構(gòu)和肺泡組織形態(tài)正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。COPD 組大鼠細(xì)支氣管管壁和基底層增厚，管腔狹窄變形甚至閉塞，其周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；上皮細(xì)胞紊亂增生，肺泡壁變薄，且部分肺泡破裂。但治療組Probiotic IMM 灌胃后，大鼠肺組織形態(tài)得到明顯改善，炎癥浸潤(rùn)和管腔增厚等癥狀有所減輕，破損肺泡數(shù)量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織（HE染色×400）

2.3 各組大鼠肺組織纖維化改變

對(duì)照組大鼠肺組織主要為紅色肌纖維，而藍(lán)色膠原纖維幾乎不可見。COPD 組大鼠肺組織藍(lán)染膠原纖維較對(duì)照組顯著增加，提示膠原沉積增多，肺組織發(fā)生嚴(yán)重纖維化。治療組Probiotic IMM 灌胃后，大鼠肺組織膠原纖維沉積明顯減少，纖維增生得到抑制。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織（Masson染色×400）

2.4 各組大鼠肺組織α-SMA的表達(dá)

COPD 組大鼠肺支氣管平滑肌α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，但治療組肺支氣管平滑肌α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)較COPD 組有所減少。見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織α-SMA的表達(dá)（免疫熒光雙染×400）

2.5 各組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平比較

對(duì)照組、COPD 組、治療組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α 水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3 533.340、327.033 和2 338.562，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：COPD 組和治療組大鼠血清CRP、IL-8 和TNF-α 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；而治療組大鼠血清CRP、IL-8 和TNF-α 水平低于COPD 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，）

表1 各組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平比較（n=10，pg/mL，）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與COPD組比較，P ＜0.05。

2.6 各組大鼠腸道菌群比較

對(duì)照組、COPD 組、治療組大鼠腸球菌、腸桿菌含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=97.180 和225.778，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：COPD 組和治療組腸球菌、腸桿菌含量高于對(duì)照組（P＜0.05）；治療組腸球菌、腸桿菌含量低于COPD 組（P＜0.05）。見表2。

對(duì)照組、COPD 組、治療組大鼠乳酸桿菌、雙歧桿菌含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=104.602 和114.833，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：COPD 組乳酸桿菌、雙歧桿菌含量低于對(duì)照組（P＜0.05）；而治療組乳酸桿菌、雙歧桿菌含量高于COPD 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腸道菌群比較（n=10，CFU/g，）

表2 各組大鼠腸道菌群比較（n=10，CFU/g，）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與COPD組比較，P ＜0.05。

3 討論

“腸-肺”軸是指胃腸道和肺的共同黏膜免疫系統(tǒng)[13]，腸道和肺之間以及腸道菌群和宿主免疫之間存在復(fù)雜而重要的交互作用，暗示腸道菌群在調(diào)節(jié)慢性呼吸道疾病炎癥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。既往研究證實(shí)，腸道微生物失調(diào)不僅參與調(diào)節(jié)宿主對(duì)呼吸道感染的免疫反應(yīng)[6]，而且促進(jìn)哮喘、COPD、肺癌和呼吸道感染等呼吸道疾病的發(fā)生、發(fā)展，加重COPD 病程，增加COPD 患者胃腸道紊亂的發(fā)生率，如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎[15]。因此，腸道微生態(tài)的改變可作為評(píng)估COPD 發(fā)病程度的生物學(xué)指標(biāo)[16]。

COPD 作為一種常見的慢性肺疾病，致病因素包括吸入香煙煙霧或其他有毒顆粒、慢性哮喘、職業(yè)性接觸粉塵，主要特征為長(zhǎng)期炎癥、肺組織破壞和氣流阻塞導(dǎo)致的肺功能下降[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD 組大鼠肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，光鏡下可見細(xì)支氣管管壁增厚，膠原沉積增多，纖維增生，管腔狹窄變形且部分堵塞，肺泡壁變薄乃至破裂，存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而治療組大鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)、膠原纖維沉積和管腔增厚等癥狀明顯減輕，提示肺損傷有所好轉(zhuǎn)。α-SMA 作為平滑肌細(xì)胞收縮的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，可被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1刺激誘導(dǎo)，促進(jìn)膠原沉積和纖維化形成，進(jìn)而加重氣道重塑[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD 組大鼠肺支氣管α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，但治療組肺支氣管α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)有所減少，提示益生菌治療可改善COPD 大鼠肺損傷，減少膠原沉積，減輕氣道重塑。

穩(wěn)定期COPD 患者的糞便微生物組和代謝組均與健康人群有顯著差異，其優(yōu)勢(shì)菌株主要為雙歧桿菌科、真桿菌科、乳酸菌科、微球菌科、鏈球菌科和細(xì)絨毛桿菌科等[19]。本研究采用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)，檢測(cè)各組大鼠腸道菌群中條件致病菌腸球菌、腸桿菌，以及腸道共生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD 組大鼠腸道中腸球菌和腸桿菌含量較對(duì)照組大幅提升，但乳酸桿菌和雙歧桿菌含量明顯下降。此時(shí)，致病菌作為優(yōu)勢(shì)菌過度生長(zhǎng)，引起菌群失調(diào)。相較于COPD組，治療組大鼠腸道中腸球菌和腸桿菌含量有所降低，伴隨著乳酸桿菌和雙歧桿菌含量增加。即口服益生菌可有效改善COPD 大鼠的腸道菌群構(gòu)成，降低條件致病菌豐度，并增加腸道共生菌含量，使之更接近于正常大鼠腸道微生態(tài)。腸道微生物群參與機(jī)體飲食成分的發(fā)酵，分解產(chǎn)生短鏈脂肪酸和氨基酸等。而這些微生物代謝產(chǎn)物可被腸黏膜組織吸收，與肺受體結(jié)合并激活免疫細(xì)胞[20]。

腸道微生態(tài)失衡導(dǎo)致呼吸道疾病惡化，致病菌產(chǎn)生的代謝物激發(fā)免疫細(xì)胞，通過淋巴和循環(huán)系統(tǒng)作用于肺黏膜，引起肺免疫反應(yīng)失衡。JOSEFOWICZ等[21]在CNS1-小鼠胃腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了輔助型T 細(xì)胞2 型炎癥，炎癥因子水平升高，且Foxp3（+）調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞也被激活。由于血清CRP、IL-8和TNF-α水平隨著病情加重而呈上升趨勢(shì)，故以上指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)評(píng)估COPD 患者病情嚴(yán)重程度有較高的臨床價(jià)值[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD組大鼠血清CRP、IL-8和TNF-α水平較對(duì)照組明顯升高，表明機(jī)體免疫反應(yīng)被激活。治療組大鼠血清CRP、IL-8 和TNF-α 水平較COPD 組顯著下調(diào)，即口服益生菌抑制COPD 大鼠炎癥反應(yīng)。雖然本課題檢測(cè)了相關(guān)炎癥因子水平以反映機(jī)體炎癥程度，但參與調(diào)控該進(jìn)程的潛在信號(hào)分子和機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，益生菌可有效改善COPD 大鼠肺損傷和腸道菌群結(jié)構(gòu)，減輕炎癥反應(yīng)和氣道重塑。