我國鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性研究進(jìn)展

董 薇 安素妨 楊紅旗 余永亮 梁慧珍

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，河南鄭州 450002）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑節(jié)草，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，多生于海拔1 600 m以上的山地半陰濕的巖石上，分布于安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部[1]。鐵皮石斛以莖入藥，是我國珍貴的中藥材之一，有“藥中黃金”的美稱，可益胃生津、滋陰清熱[2]。鐵皮石斛中還有多種活性成分如石斛多糖等，能清除體內(nèi)自由基，提高免疫力[3]，其已被列入藥食兩用產(chǎn)品目錄，市場需求量大，具有重要的開發(fā)價值。

1 鐵皮石斛種質(zhì)資源分類

鐵皮石斛野生資源從云南到河南均有分布，不同地域的鐵皮石斛農(nóng)藝性狀如株高、莖粗、葉面積、葉長寬比以及含水量、總多糖、水溶性多糖和纖維素含量等方面均存在差異。在理化分析應(yīng)用前，藥農(nóng)以“口嚼無渣、黏性強(qiáng)”來判定鐵皮石斛質(zhì)量的好壞，并將鐵皮石斛分為“硬腳”和“軟腳”2種。丁小余等[4]通過形態(tài)解剖，觀察到“軟腳”莖短而柔軟，有黏性，顯微觀察，表皮蠟質(zhì)豐富，沒有下皮層，橫切面維管束密度小，并且維管束內(nèi)外側(cè)纖維群不發(fā)達(dá)，尤其適合加工成鐵皮楓斗；“硬腳”莖長質(zhì)硬，黏性差，不適合加工楓斗。徐 程等[5]通過理化試驗測定含水量、總多糖、可溶性多糖和纖維素含量后發(fā)現(xiàn)，江西、廣西、廣東屬“硬腳”（H 型）范疇，云南、福建、湖南、富陽、雁蕩屬“軟腳”（F型）范疇。丁小余等[4]采集分析廣西、貴州、云南三省6個鐵皮石斛自然居群，其中廣西5個族群中2個為“軟腳”，3個為“硬腳”，按照自然居群分類更加細(xì)致準(zhǔn)確，也更說明了鐵皮石斛在相同省份同樣存在種質(zhì)資源遺傳多樣性。

2 鐵皮石斛新種質(zhì)創(chuàng)制

詹忠根等[6]用137Cs γ射線照射鐵皮石斛種胚原球莖，并經(jīng)農(nóng)藝性狀觀察和流式細(xì)胞儀分析，獲得了一些能夠保持葉片白色條斑或綠色條斑等變異性狀的變異苗，但該變異品種還需要進(jìn)一步研究是否為純合體。謝小波等[7]用γ射線照射仙斛1號，少數(shù)分子標(biāo)記表現(xiàn)差異條帶；石斛多糖沒有明顯差異，可能原因是突變概率低或者變異少，不足以影響群體石斛多糖水平。另外，兩者在對石斛原球莖的半致死劑量上有分歧。詹忠根等認(rèn)為在劑量率為5.0 Gy/min時輻照半致死劑量為67.23 Gy；謝小波等[7]認(rèn)為在1.0 Gy/min劑量率下半致死劑量為86.4 Gy，輻照劑量與半致死劑量在動物和醫(yī)學(xué)上成反比關(guān)系，但在植物上尚不明確。

廖蘇梅[9]用秋水仙素溶液浸泡鐵皮石斛原球莖或已萌發(fā)的種胚后培養(yǎng)得到了鐵皮石斛多倍體，并經(jīng)過顯微觀察、流式細(xì)胞術(shù)儀和理化分析，誘變植株都是倍性嵌合體，并且變異株氣孔增大，單位面積氣孔數(shù)減少，而保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)明顯增多，過氧化物同工酶譜有明顯差異，但酯酶同工酶無差異。胡松梅等[10]用硫酸二乙酯對鐵皮石斛原球莖進(jìn)行化學(xué)誘變，得到的一級小苗游離脯氨酸含量比對照株高。

3 鐵皮石斛種質(zhì)資源表型遺傳多樣性分析

胡衛(wèi)珍等[11]調(diào)查來自臺州、金華、德清、建德、樂清、安吉等基地鐵皮石斛種源的農(nóng)藝性狀和多糖，結(jié)果表明，不同種源之間形態(tài)特征如葉片形狀、葉片顏色、葉鞘顏色、莖稈粗細(xì)程度、葉鞘是否具有豎條紋、是否帶紫斑、紫斑數(shù)量差異較大；多糖含量有顯著差異，莖粗與多糖含量成顯著負(fù)相關(guān)。史驥清等[12]對不同地域的兩年生以上鐵皮石斛苗進(jìn)行抗寒性研究，發(fā)現(xiàn)各種源鐵皮石斛抗寒性有明顯差異，浙江種源抗寒性最好，福建種源次之。溫婷梅等[13]將福建地區(qū)和其他地區(qū)的鐵皮石斛農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較，結(jié)果表明，云南鐵皮石斛的植株高差異最小，廣西的差異最大；富陽鐵皮石斛的莖粗差異最小，云南的最大；云南鐵皮石斛的植株葉面積比差異最小，湖南的最大。黃澤豪等[14]顯微鑒別研究福建冠豸山野生鐵皮石斛，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛顯微特征比其他石斛明顯，但從顯微鑒別方面很難區(qū)分鐵皮石斛生產(chǎn)地域。包英華等[15]徒手切片并對鐵皮石斛進(jìn)行顯微鑒定，結(jié)果顯示，角質(zhì)層比較薄，厚度約4.9 μm，表皮細(xì)胞為不均勻加厚型，表皮細(xì)胞壁厚度為12.0～13.0 μm，厚壁組織厚度為 15.7～17.5 μm。

4 鐵皮石斛種質(zhì)資源分子遺傳多樣性分析

4.1 DNA條碼

DNA條碼是利用生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段鑒定物種及物種間親緣關(guān)系。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物多樣性評估、遺傳多樣性分析、植物藥材真?zhèn)舞b定等方面[16-20]。鐵皮石斛的ITS序列和葉綠體rbc L基因與其他石斛間存在特異性序列位點，可以將它們作為鑒別石斛屬種間的條形碼基因[21-22]。丁小余等[23]首次報道了鐵皮石斛的ITS區(qū)堿基序列，ITS區(qū)的總長度為634 bp，其中ITS1長231 bp，5.8S長163 bp，ITS2長240 bp。在鐵皮石斛廣西、貴州、云南主要居群中，F(xiàn)型與H型居群植株的rDNA ITS區(qū)的堿基序列有2個差異位點，變異分別發(fā)生在ITS1區(qū)和5.8S區(qū)內(nèi)。在F型與H型居群間，其5.8S rDNA區(qū)存在單核苷酸多態(tài)（SNP）現(xiàn)象，鐵皮石斛居群內(nèi)部rDNA ITS區(qū)的差異與植物生活型的差異成一定的相關(guān)性，H型居群的鐵皮石斛是F型的變種。宋劍波等[24]也成功用ITS2序列將30個不同外形江西龍虎山鐵皮石斛樣品分類為9個品種，其種內(nèi)遺傳距離為0～0.005，6個樣本為龍虎山特有的鐵皮石斛品種。同時，通過建立DNA條形碼的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，6個特有品種變異程度小，由同一分支進(jìn)化而來。付 濤等[25]研究發(fā)現(xiàn)單個條形碼鑒定率均低于60%，核心條形碼matK+rbcL鑒定率也較低（68.75%），但核心條形碼結(jié)合其他序列（matK+rbcL+petA-psbJ）鑒定率可達(dá)100%，可以用于鐵皮石斛分子鑒定。陳文強(qiáng)等[26]探討目前常用的9條植物DNA條形碼（ITS2、mat K、nad1、ycb L、trn L-trn F、trn G-trn S、psb K-psb I、rbc L和trn H-psb A）在石斛材料分子鑒定中的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)ITS2和trn L-trn F對試驗選用石斛材料的鑒定率達(dá)到90.1%，并且確定鐵皮石斛種質(zhì)資源鑒定的DNA條形碼ITS2+trn L-trn F為最佳。DNA條形碼和實時熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)高效。陳雪燕等[27]以ITS序列為靶基因，設(shè)計鐵皮石斛特異引物、特異探針，使用實時熒光定量PCR（Taq Man）技術(shù)，有效鑒定參試樣品中的25份鐵皮石斛。

4.2 SSR標(biāo)記

石汝杰等[28]利用微衛(wèi)星序列搜索和統(tǒng)計軟件MSDB v2.4將鐵皮石斛全基因組中完整型微衛(wèi)星序列和其特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可為SSR引物篩選提供依據(jù)。謝明璐等[29]首次將SSR標(biāo)記用于鐵皮石斛種質(zhì)純度鑒定和真實性判別。Yue等[30]、徐蕾等[31]、趙瑞強(qiáng)[32]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)開展不同地方種源的鐵皮石斛遺傳多樣性分析、種群分類等研究，為今后的遺傳輔助育種提供科學(xué)依據(jù)。董曉曼等[33]使用生物信息學(xué)方法分析鐵皮石斛的全基因組SSR序列，將11個滇、皖產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛居群分為三支，鐵皮石斛居群與種質(zhì)來源分布相一致，并篩選了4對多態(tài)性高、帶型清晰的引物組合，利用在線二維碼生成器，建立了鐵皮石斛分子身份證。余文霞等[34]使用4對SSR引物對9個鐵皮石斛主產(chǎn)區(qū)的29個居群進(jìn)行檢測分析并構(gòu)建DNA身份證，聚類分析將樣本分成四大類，并且表現(xiàn)出地域相關(guān)性。胡仲義等[35]篩選20對多態(tài)性較好的引物，其中DN4+DN10+DN105+DN39的引物組合可作為核心引物使用，用于鐵皮石斛的指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，并且引物 DN4、DN13、DN39、DN58、DN65、DN67、DN10和DN99可以鑒定鐵皮石斛和串珠石斛。

4.3 ISSR標(biāo)記

沈潔等[36]首次建立了鐵皮石斛的ISSR-PCR分析最適反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系25 μL，配套緩沖液10×Taq酶，Taq DNA 聚合酶 1.5 U，MgCl21.2～1.8 mmol/L，dNTP 80 μmol/L， 引物 0.2 μmol/L，DNA模板約20 ng，退火溫度52～60℃。段媛媛等[37]采用均勻設(shè)計和單因素試驗結(jié)合的方法，探索出ISSR-PCR擴(kuò)增穩(wěn)定性強(qiáng)的反應(yīng)體系用于鐵皮石斛鑒定：20 μL反應(yīng)體系，含 2×Taq Master Mix 11.5 μL、模板 DNA 35 ng和引物0.4 μmol/L。沈 穎等[38]首次將ISSRPCR方法用于石斛種間鑒別，選用的10條引物中，7條擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，其中2條引物（UBC-807和UBC-864）可獨(dú)立區(qū)分所有被測樣品，能夠?qū)㈣F皮石斛與其他種石斛區(qū)分開來，證明了此方法可用于石斛屬種間鑒別。Shen等[39]、李永清等[40]、江金蘭等[41]、鹿 炎等[42]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)開展不同地方種源鐵皮石斛多樣性分析、種群分類研究。

4.4 RAPD標(biāo)記

丁鴿等[43]篩選隨機(jī)引物對 10個，并通過UPGMA進(jìn)行聚類分析，共篩選出10個有效引物，擴(kuò)增得到439個位點，獲得了104條可重現(xiàn)譜帶，其中9條單態(tài)條帶，95條多態(tài)條帶，多態(tài)性達(dá)到91.35%，遺傳距離為0.590～0.727，平均為0.686。苑 鶴等[44]篩選15個引物分析浙江義烏、天臺、建德、武義，云南麻栗坡、勐海的14個栽培居群鐵皮石斛和1個紫皮石斛的遺傳多樣性，利用PopGen32軟件進(jìn)行聚類分析，將14個居群分為兩支：I支包含9個浙江居群（A1-F9），II支包含 2 個浙江居群（G10-H11）和 3 個云南居群（A12-D15），其中H11居群種源并非來自浙江，G10居群種源來源于貴州。居群間親緣關(guān)系與地理種源顯著相關(guān)，種質(zhì)資源地理位置相近的具有較近的遺傳基礎(chǔ)。全國主產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛在相似系數(shù)0.659 0處全部都聚在一起，與其近緣種紫皮石斛存在區(qū)別明顯。

4.5 RAMP標(biāo)記

沈潔等[45]選用RAMP標(biāo)記16對引物組合，檢測9個鐵皮石斛野生居群的112個樣本，使用NTSYS-pc（version 2.10s）軟件聚類分析，9 個鐵皮石斛的野生居群被分為3個類群，且聚類結(jié)果表現(xiàn)出較好的地域相關(guān)性。

4.6 SCoT標(biāo)記

袁晨琳等[46]建立并優(yōu)化了鐵皮石斛SRAP-PCR反應(yīng)體系，確定鐵皮石斛SRAP-PCR模板30 ng時的最適宜擴(kuò)增體系為Taq酶濃度1.5 U、d NTP濃度 0.25 mmol/L、引物濃度 0.10 μmol/L、Mg2+濃度2.0 mmol/L，同時對7個產(chǎn)地鐵皮石斛總DNA進(jìn)行擴(kuò)增分析遺傳多樣性，共得到77條條帶，特異性分子標(biāo)記39個，多態(tài)率達(dá)到51%，將7個產(chǎn)地鐵皮石斛分為4類，得出其遺傳差異與地理分布之間無較大關(guān)聯(lián)的結(jié)論。徐旭棟等[47]從56個引物中篩選20個SCoT引物，用NTsys-2.1軟件聚類分析，在遺傳系數(shù)0.67的水平上，將不同來源的20份人工栽培鐵皮石斛樣品分為兩大類。趙瑞強(qiáng)[32]篩選出28條SCoT引物，共擴(kuò)增出366條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率（PPB）為94.76%；17 個居群的多態(tài)位點（PPL）為28.83%～64.42%，平均45.73%，聚類結(jié)果將不同來源的鐵皮石斛聚在一起，但也有例外。趙瑞強(qiáng)[32]還將SCoT和SSR標(biāo)記結(jié)合鐵皮石斛居群進(jìn)行多樣性分析，不同居群間表現(xiàn)遺傳多樣性，不同來源鐵皮石斛種質(zhì)資源的親緣關(guān)系與地理緯度關(guān)系密切。

4.7 SRAP標(biāo)記

包英華等[15]從64對SRAP引物的組合中篩選出7對有效引物組合，運(yùn)用PopGen32軟件將8個居群鐵皮石斛分為4類，并得出居群內(nèi)遺傳分化偏高于居群間的結(jié)論。周麗等[48]采用SRAP標(biāo)記分析黔西南州野生鐵皮石斛和相關(guān)種類石斛的23個樣品的遺傳多樣性，在遺傳相似性系數(shù)為0.74處將23份樣品分為6大類，并且SRAP分類結(jié)果與植物學(xué)形態(tài)分類的結(jié)果統(tǒng)一。李懷志等[49]使用25對SRAP標(biāo)記成功構(gòu)建了20份石斛品系的SRAP特征指紋圖譜。楊 貞等[50]從81對引物中篩選出15對引物，將13份中國不同產(chǎn)地鐵皮石斛材料劃分為3個類群。

4.8 TRAP標(biāo)記

劉玲[51]篩選8對TRAP引物將9個鐵皮石斛野生居群聚類為四大支。張君毅等[52]開發(fā)TRAP和SCAR標(biāo)記，分析3個鐵皮石斛生態(tài)類群的46份種質(zhì)，并進(jìn)行野生群體鑒別和抗寒性篩選。以抗寒相關(guān)的CBF1/DREB1轉(zhuǎn)錄因子和鈣依賴型蛋白激酶（CDPK1）基因設(shè)計的57對TRAP固定引物中篩選出21個引物組合，分析結(jié)果顯示，野生類群鐵皮石斛遺傳多樣性水平最高，而仿野生類群和栽培類群基本一致。主成分分析（PCA）結(jié)果將供試材料分為野生和栽培兩大類群。同時，還開發(fā)了一個鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄因子（RAP2-4）的SCAR標(biāo)記，并利用該標(biāo)記和TRAP固定引物共同篩選出了核心抗寒種質(zhì)資源。

4.9 CDDP標(biāo)記

吳永輝等[53]從21條CDDP引物中篩選出16條引物對43份鐵皮石斛野生和栽培種質(zhì)進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出了151條帶，其中多態(tài)性條帶144條，多態(tài)性比率95.4%，遺傳多樣性豐富。通過多態(tài)性位點比例（65.56%～82.12%）、種群間基因分化系數(shù)（0.110 2）、基因流（4.035 4）的分析，說明人為選擇也可能促進(jìn)鐵皮石斛遺傳多樣性。

5 展望

鐵皮石斛作為珍稀名貴中藥材，具有重要的藥用價值，應(yīng)用前景廣闊。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)手段的不斷更新，鐵皮石斛在分子生物學(xué)和多組學(xué)技術(shù)結(jié)合的研究必會越來越深入。