細(xì)胞初級(jí)纖毛在骨代謝中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

胡小江 張宏其 郭超峰 唐明星 劉少華 李艷冰 張廣 李石磊 李韜 高琪樂(lè)*

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院脊柱外科和骨科，湖南 長(zhǎng)沙 410008 2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410008

1 初級(jí)纖毛與骨質(zhì)疏松

初級(jí)纖毛是細(xì)胞表面的一種以微管為基礎(chǔ)的纖細(xì)的細(xì)胞器，存在于單細(xì)胞真核生物和人類等脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中[1]。纖毛與質(zhì)膜之間有連續(xù)的膜將其連接在一起，但纖毛由獨(dú)特的脂質(zhì)和受體組成，使纖毛能夠檢測(cè)細(xì)胞外環(huán)境的變化，并向細(xì)胞傳遞信號(hào)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過(guò)程。因此，原發(fā)性纖毛功能障礙會(huì)導(dǎo)致一組稱為纖毛病的綜合性疾病，在胚胎發(fā)育及個(gè)體生長(zhǎng)中會(huì)影響許多不同的器官和系統(tǒng)，與其相關(guān)疾病包括肥胖、心血管和腎臟疾病、聽力和視力喪失，甚至癌癥等。目前，在這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)研究較廣泛的疾病為腎囊腫、肝囊腫以及骨質(zhì)疏松[2-3]。

骨質(zhì)疏松癥是一種因?yàn)楣橇繙p低、骨組織微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致骨骼脆性增加的全身性骨骼疾病，通常會(huì)引起骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，是老年人骨折最常見的原因[4]。最新的研究表明，婦女絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松與骨細(xì)胞初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)的破壞緊密相關(guān)[5-6]。初級(jí)纖毛與骨質(zhì)疏松、骨代謝之間存在密切的聯(lián)系[7-10]。

2 初級(jí)纖毛調(diào)節(jié)骨代謝的相關(guān)信號(hào)通路

初級(jí)纖毛是許多信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)中樞，例如酪氨酸激酶受體(RTK)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)通路、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、Hedgehog/(Wnt)通路、Notch通路等，同時(shí)初級(jí)纖毛也是雷帕霉素的機(jī)制靶點(diǎn)(mTOR)[11]。以上通路均參與了機(jī)體骨代謝過(guò)程，現(xiàn)將研究較多的通路分述如下。

2.1 Hedgehog信號(hào)通路

Hedgehog信號(hào)通路是最早被發(fā)現(xiàn)的與初級(jí)纖毛信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的通路，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增值分化和凋亡的功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松與初級(jí)纖毛和Hedgehog信號(hào)通路有關(guān)：雌激素撤退導(dǎo)致骨細(xì)胞表面的初級(jí)纖毛伸長(zhǎng)，從而引起骨細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路的表達(dá)增加。骨細(xì)胞的Hedgehog信號(hào)可以通過(guò)增加RANKL/OPG等信號(hào)促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成[5]。最新的研究發(fā)現(xiàn)了存在于初級(jí)纖毛中的成骨細(xì)胞Hedgehog通路的負(fù)性調(diào)控因子SLITRK5，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，成骨細(xì)胞SLITRK5的缺失導(dǎo)致Hedgehog信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)，而SLITRK5的過(guò)表達(dá)則會(huì)抑制Hedgehog信號(hào)通路的表達(dá)。其機(jī)制是Hedgehog通路的表達(dá)可以使細(xì)胞上初級(jí)纖毛數(shù)量增多，而SLITRK5是Hedgehog通路的負(fù)性調(diào)控因子，其低表達(dá)或者缺失會(huì)使Hedgehog通路表達(dá)上調(diào)[13]。

2.2 WNT信號(hào)通路

Wnt信號(hào)在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的維持和分化中起著至關(guān)重要的作用。由Wnt控制的信號(hào)通路可分為典型(β-連環(huán)蛋白通路)和非典型(平面細(xì)胞極性和Wnt/Ca2+通路)兩類，依賴于β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定的Wnt通路被稱為WNT/β-連環(huán)蛋白通路，具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增值和分化的作用[11]。但對(duì)于這個(gè)領(lǐng)域的研究一直以來(lái)存在很多矛盾和分歧：Corbit等[14]在2008年的研究結(jié)果顯示原發(fā)性纖毛缺失或破壞可導(dǎo)致WNT/β-連環(huán)蛋白通路活性上調(diào)；Bernatik等[15]在2021年的研究發(fā)現(xiàn)，在使用WNT激活劑(WNT3a)激活該通路條件下細(xì)胞初級(jí)纖毛的數(shù)量、長(zhǎng)度相對(duì)于阻斷該通路的細(xì)胞初級(jí)纖毛無(wú)明顯差異，這表明WNT/β-連環(huán)蛋白通路的上調(diào)對(duì)初級(jí)纖毛形成沒(méi)有明顯作用。Bernatik等[15]的研究與之前研究結(jié)果的差異可能的原因有幾個(gè)方面：①此研究是使用新型的重組WNT3a激活了WNT/β-連環(huán)蛋白通路，而之前的研究中經(jīng)常使用的是WNT3a條件培養(yǎng)基。WNT/β-連環(huán)蛋白通路的完全激活、初級(jí)纖毛形成通常發(fā)生在適當(dāng)刺激后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，而細(xì)胞在WNT3a條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)需較長(zhǎng)時(shí)間，而此研究均在72 h內(nèi)完成。②一些文獻(xiàn)報(bào)道的纖毛長(zhǎng)度或厚度的變化實(shí)際上是通過(guò)乙?；?微管蛋白抗體染色觀察纖毛微管蛋白乙?；淖兓?，現(xiàn)有證據(jù)表明纖毛微管蛋白在纖毛各個(gè)部位的表達(dá)具有顯著差異，不能準(zhǔn)確測(cè)定纖毛的長(zhǎng)度，而Bernatik等[15]是通過(guò)對(duì)Arl13b染色來(lái)觀察纖毛，Arl13b是一種來(lái)自Arf/Arl家族的小GTP酶，在纖毛膜中高度富集，可用于直接測(cè)定的纖毛的大小。雖然WNT通路對(duì)于初級(jí)纖毛不具有調(diào)節(jié)作用，但大量研究表明，初級(jí)纖毛對(duì)WNT通路具有顯著的調(diào)控作用[16-17]。

2.3 TGF-β信號(hào)通路

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β超家族有幾十個(gè)成員，其中比較常見的包括TGF-β1/2/3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)，它們都具有相同結(jié)構(gòu)——一個(gè)疏水信號(hào)序列、一個(gè)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)成熟的C末端結(jié)構(gòu)域。這個(gè)超家族所有成員對(duì)細(xì)胞的增值分化和胚胎發(fā)育都具有重要作用[18]。

MSCs的募集是組織發(fā)育、維持和修復(fù)的關(guān)鍵過(guò)程。TGF-β是一種有效的趨化因子，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的募集至關(guān)重要，在干細(xì)胞增殖和分化中起著關(guān)鍵作用。初級(jí)纖毛是BMSCs中TGF-β信號(hào)通路激活所必需的，根據(jù)免疫熒光結(jié)果表明，TGF-β受體、SMAD2、SMAD3和SMAD4都主要定位于BMSCs的初級(jí)纖毛，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果。人為敲低調(diào)控纖毛產(chǎn)生的基因IFT88后可見纖毛長(zhǎng)度變小的同時(shí)磷酸化SMAD2/3的水平也顯著降低。另外，IFT88基因敲低后BMSCs的遷徙能力降低，表明初級(jí)纖毛在骨骼疾病的發(fā)生機(jī)制中具有關(guān)鍵作用[19]。對(duì)于成骨細(xì)胞來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，TGF-β1通過(guò)HDAC6基因介導(dǎo)初級(jí)纖毛縮短和變形以及纖毛數(shù)量的減少；TGF-β通過(guò)失活骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2和BMP7(誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的主要蛋白)抑制成骨細(xì)胞的成熟和分化[20]。在另外的研究中表明，TGF-β對(duì)于纖毛的抑制作用是通過(guò)抑制IFT88基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[21]。總之，TGF-β對(duì)于骨代謝的影響呈現(xiàn)兩面性，一方面通過(guò)激活BMSCs初級(jí)纖毛中的TGF-β/SMAD信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs的募集從而促進(jìn)成骨，另一方面通過(guò)調(diào)控各基因的表達(dá)使初級(jí)纖毛變形、減少、功能減退，從而使得成骨細(xì)胞成骨分化受到抑制。對(duì)于TGF-β在成骨方面的兩面性目前尚未研究透徹，這也是目前骨代謝方面研究的重點(diǎn)方向。

此外，最新的文獻(xiàn)報(bào)道了中心粒附屬器蛋白CEP128，CEP128的缺失可在不影響初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和數(shù)量的基礎(chǔ)上導(dǎo)致斑馬魚細(xì)胞的初級(jí)纖毛中TGF-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)通路功能受損，原因可能與纖毛上部分囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷有關(guān)[22]。因此CEP128可能會(huì)成為初級(jí)纖毛研究的新方向。

3 初級(jí)纖毛基因水平的調(diào)控對(duì)骨代謝的影響

3.1 IFT80

纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(IFT)是一系列維持纖毛結(jié)構(gòu)和功能的蛋白。IFT以及調(diào)節(jié)的基因的缺失將會(huì)導(dǎo)致纖毛結(jié)構(gòu)的破壞和功能缺失。Liu等[23]在對(duì)小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，利用他莫昔芬(tamoxifen)誘導(dǎo)構(gòu)建條件敲除IFT80的小鼠股骨骨折模型，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠骨折愈合處骨體積、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度顯著降低，骨小梁間距更大。與對(duì)照組小鼠相比，骨細(xì)胞中IFT80的缺失導(dǎo)致骨折骨痂中纖毛形成受損和軟骨細(xì)胞增殖減慢。在對(duì)于椎間盤退變的機(jī)制研究中表明，IFT80的缺失導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞凋亡顯著增加，并顯著降低軟骨形成標(biāo)志物(Ⅱ型膠原蛋白、SOX9、蛋白聚糖和Hedgehog信號(hào)成分等)的表達(dá)，IFT80對(duì)于維持椎間盤細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和功能具有重大作用。

3.2 IFT88

IFT88是纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物B的中心成分，對(duì)于纖毛的構(gòu)建至關(guān)重要。前述已提到IFT88基因調(diào)控纖毛的產(chǎn)生和其功能的發(fā)揮，且這一過(guò)程與TGF-β有關(guān)。需要注意的是，IFT88缺失能夠顯著減弱細(xì)胞的遷徙能力，但關(guān)于IFT88如何影響細(xì)胞遷徙的機(jī)制還需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步深入探討[24]。直到2020年Lee等[25]的研究表明，骨橋蛋白(OPN)是 BMSCs 向骨重塑部位遷移的重要化學(xué)引誘劑。初級(jí)纖毛的缺失減少了 OPN 介導(dǎo)的 BMSCs 遷移，初級(jí)纖毛作為 OPN 的化學(xué)引誘物傳感器，不僅通過(guò)控制 CD44 介導(dǎo)的 OPN 信號(hào)傳導(dǎo)，還通過(guò)控制Cdc42介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排來(lái)調(diào)節(jié)BMSCs遷移。

3.3 KIF3A

順行纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)動(dòng)蛋白KIF3A可調(diào)節(jié)初級(jí)纖毛的完整性和各種細(xì)胞功能。Jiang等[26]研究表明，KIF3A在人牙髓細(xì)胞中的表達(dá)被敲低后，導(dǎo)致初級(jí)纖毛數(shù)量顯著減少，從而導(dǎo)致大量成骨分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)受損，Wnt3a/β-catenin的表達(dá)水平減弱。由于KIF3A完全不表達(dá)的小鼠胚胎無(wú)法繼續(xù)發(fā)育，因此，Qiu等[27]的研究中建立了以骨鈣素(Oc)-Cre介導(dǎo)小鼠部分KIF3A的條件性缺失的模型，成骨細(xì)胞中Oc-Cre介導(dǎo)小鼠KIF3A的條件性缺失減少了初級(jí)纖毛的產(chǎn)生和功能，并通過(guò)多種途徑損害成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成，包括骨鈣素減少、Hedgehog介導(dǎo)的Gli2表達(dá)減少、Wnt3a介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白和Axin2表達(dá)減弱。

4 初級(jí)纖毛調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是研究最廣泛的成骨細(xì)胞祖細(xì)胞來(lái)源，它在體外可以根據(jù)生物物理信號(hào)進(jìn)行成骨細(xì)胞分化，這些生物物理信號(hào)包括生理循環(huán)靜水壓、流體流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力、骨基質(zhì)形變和剛度和電磁場(chǎng)等，初級(jí)纖毛在BMSCs在生物物理信號(hào)的接受和傳遞中具有重大作用。此外，機(jī)械刺激也能增加骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞上初級(jí)纖毛的數(shù)量，且能通過(guò)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的初級(jí)纖毛依賴性和 Gli-1 依賴性途徑調(diào)節(jié)成骨反應(yīng)[28]。骨細(xì)胞上的初級(jí)纖毛比BMSCs上的纖毛更容易感受到微弱的機(jī)械刺激[29]。

機(jī)械敏感鈣通道瞬時(shí)受體電位亞家族第四成員(TRPV4)在BMSCs中主要表達(dá)在初級(jí)纖毛上。使用TRPV4特異性拮抗劑GSK205拮抗TRPV4會(huì)導(dǎo)致BMSCs中振蕩流體剪切誘導(dǎo)的鈣信號(hào)完全喪失；使用TRPV4特異性激動(dòng)劑GSK101可以誘導(dǎo)產(chǎn)生與振蕩流體剪切力誘導(dǎo)的信號(hào)相似的鈣信號(hào)，TRPV4特異性激動(dòng)劑GSK101對(duì)于骨代謝疾病應(yīng)用的研究尚未見報(bào)道[30]。

BMSCs機(jī)械傳導(dǎo)的信號(hào)通路利用cAMP作為第二信使，這個(gè)第二信使是通過(guò)位于BMSC初級(jí)纖毛中的腺苷酸環(huán)化酶-6(AC-6)激活，這種機(jī)械傳導(dǎo)機(jī)制被證明可以作為治療靶點(diǎn)，cAMP信號(hào)可通過(guò)AC激活劑進(jìn)行生物化學(xué)激活，來(lái)增強(qiáng)cAMP信號(hào)和早期成骨信號(hào)，是一種潛在的治療骨質(zhì)疏松等疾病的方法[31]。

對(duì)骨骼的機(jī)械刺激是骨骼密度維持和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定所必需的，其刺激可通過(guò)BMSCs、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等細(xì)胞表面的初級(jí)纖毛所感受；BMSCs是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，BMSCs功能的發(fā)揮與成骨密切相關(guān)[32]。以下將介紹3個(gè)研究較多的骨骼物理刺激信號(hào)，以總結(jié)BMSCs初級(jí)纖毛成骨的相關(guān)研究方法。

4.1 低強(qiáng)度機(jī)械刺激

Curtis等[33]發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度機(jī)械刺激(LMMS)誘導(dǎo)的成骨與BMSCs密切相關(guān)。Coughlin等[34]使用生物反應(yīng)器對(duì)小梁骨塊進(jìn)行低強(qiáng)度機(jī)械刺激(以0.3×g的LMMS在30 Hz下刺激骨小梁體外骨塊)，結(jié)果表明從機(jī)械刺激組中獲取的BMSCs比對(duì)照組的BMSCs增值能力更強(qiáng)，而通過(guò)水合氯醛破壞細(xì)胞表面的初級(jí)纖毛后，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的增值能力沒(méi)有顯著差異，這證明LMMS能促進(jìn)成骨，且其成骨的促進(jìn)作用與BMSCs表面的初級(jí)纖毛密切相關(guān)。

4.2 流體剪切應(yīng)力

流體剪切應(yīng)力在BMSCs中誘導(dǎo)成骨反應(yīng)。其作用的應(yīng)力大小、頻率和持續(xù)時(shí)間不同，誘導(dǎo)的成骨反應(yīng)效力也不同。Chi等[35]通過(guò)測(cè)定短期流體流動(dòng)刺激后成骨標(biāo)志物Cox2、Runx2和OPN的mRNA表達(dá)，確定了在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中BMSCs在2 Pa剪切幅度和2 Hz頻率的流體剪切應(yīng)力下成骨基因的表達(dá)最穩(wěn)定且較顯著上升。有足夠證據(jù)表明流體剪切應(yīng)力信號(hào)是由BMSCs表面的初級(jí)纖毛接受并傳遞的，且這一效應(yīng)是由TRPV4介導(dǎo)的[30]。

4.3 脈沖電磁場(chǎng)

脈沖電磁場(chǎng)(pulsed electromagnetic fields，PEMFs)是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的潛在治療方法，之前的研究結(jié)果表明，PEMFs通過(guò)激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-Smad1/5/8信號(hào)，促進(jìn)大鼠顱骨成骨細(xì)胞的成骨分化和成熟。PEMFs通過(guò)初級(jí)纖毛介導(dǎo)的BMP受體Ⅱ(BMPRⅡ)表達(dá)上調(diào)和隨后BMP-Smad1/5/8信號(hào)的激活，刺激成骨細(xì)胞的成骨分化和成熟[36]。最新的研究表明，極低頻脈沖電磁場(chǎng)(16 Hz)也增強(qiáng)了BMSCs細(xì)胞的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，增加Smad2、3和7表達(dá)[37]。其他研究表明，脈沖電磁場(chǎng)也通過(guò)初級(jí)纖毛介導(dǎo)的COX2-PGE2通路信號(hào)傳導(dǎo)和EP4表達(dá)促進(jìn)成骨[38]、通過(guò)成骨細(xì)胞表面的初級(jí)纖毛激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)骨形成活性和分化[39]。

5 臨床應(yīng)用

近來(lái)，對(duì)初級(jí)纖毛和骨代謝的相關(guān)研究逐年增多，但對(duì)于其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的研究才剛剛起步。目前，治療骨質(zhì)疏松癥的新方向是通過(guò)靶向誘導(dǎo)成骨細(xì)胞及MSCs成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)骨形成。在此過(guò)程中調(diào)控初級(jí)纖毛功能可作為靶向治療骨質(zhì)疏松的一種潛在治療方式。例如，上文中提及的腺苷酸環(huán)化酶(AC)激動(dòng)劑激活cAMP信號(hào)模擬機(jī)械刺激誘導(dǎo)成骨反應(yīng)；TRPV4特異性激動(dòng)劑GSK101可能用于模擬機(jī)械負(fù)荷的成骨作用；以及脈沖電磁場(chǎng)作用下的成骨誘導(dǎo)等都是致力于尋找初級(jí)纖毛靶向治療的可能性與可行性。

另外，藥物研究表明，氯化鋰(LiCl)和非諾多泮(fenoldopam)兩種藥物都增強(qiáng)了BMSCs表面的纖毛的數(shù)量和長(zhǎng)度。且BMSCs的機(jī)械敏感性增加，導(dǎo)致成骨基因的表達(dá)上調(diào)，但較長(zhǎng)時(shí)間使用氯化鋰會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性的降低，所以氯化鋰不能用于纖毛的靶向治療；而非諾多泮在其使用的早期對(duì)于成骨是起到促進(jìn)作用，而長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用下并未發(fā)現(xiàn)其顯著的促進(jìn)成骨作用，因此，非諾多泮調(diào)控初級(jí)纖毛靶向治療骨質(zhì)疏松更具備可行性HEDGEHOG[40]。纖毛靶向藥物機(jī)制的研究尚剛起步，其臨床應(yīng)用尚無(wú)報(bào)道，在未來(lái)，纖毛靶向藥物的前景如何還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，對(duì)于初級(jí)纖毛的研究目前已有了較為深入的認(rèn)識(shí)，尤其是其形態(tài)、功能的研究，以及基因調(diào)控方面的研究均已經(jīng)比較完善。目前對(duì)初級(jí)纖毛的體外模型、體內(nèi)模型的構(gòu)建均有了一定程度的認(rèn)識(shí)[41]。但是，初級(jí)纖毛功能的具體機(jī)制研究尚有分歧，尤其是初級(jí)纖毛通路的機(jī)制研究尚未完全明確；此外，對(duì)于初級(jí)纖毛臨床應(yīng)用研究，尤其是骨質(zhì)疏松方面的纖毛靶向治療也剛剛起步，但其可行性與運(yùn)用前景仍然十分良好，可為骨質(zhì)疏松的治療提供新的方向。