機械敏感離子通道蛋白Piezo1響應(yīng)機械力刺激調(diào)節(jié)骨代謝的研究進展

李晶 馬鐵 宋成林 李濤 高海寧 姚婷婷 晉俊杰 張超 胡廣璇 刁小芮 衣雪潔 常波*

1.遼寧師范大學(xué)體育學(xué)院，遼寧 大連 116029 2.沈陽體育學(xué)院運動人體科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110102 3.沈陽體育學(xué)院實驗室管理中心，遼寧 沈陽 110102 4.沈陽體育學(xué)院研究生部，遼寧 沈陽 110102 5.沈陽體育學(xué)院運動與健康研究中心，遼寧 沈陽 110102

1 機械敏感離子通道概述

自然界中，凡是具有生命的個體在生長發(fā)育過程中時刻接受來自外界的機械刺激從而產(chǎn)生感知和響應(yīng)。在哺乳動物中，骨的穩(wěn)態(tài)感應(yīng)會受機械力刺激傳導(dǎo)[1]。機械敏感離子通道可以在毫秒級的時間內(nèi)充當(dāng)機械刺激的分子傳感器，并在打開時將機械刺激轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)的電信號或化學(xué)信號[2]，該通道是完整成孔的膜蛋白[3]?？身憫?yīng)施加在細(xì)胞膜上的機械刺激，控制通道的封閉和開放達到允許離子和其他溶質(zhì)流過細(xì)胞膜的目的[4]。

2 機械敏感陽離子通道蛋白Piezo1的生理特點

2010年，在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤(mouse neuroblastoma，N2A)細(xì)胞系的研究中，發(fā)現(xiàn)由Fam38A所調(diào)控的蛋白質(zhì)是一種離子通道，可以被壓力激活產(chǎn)生穩(wěn)定電流。研究者將其命名為 Piezo1，意義是“壓力”，Piezo1為N2A中產(chǎn)生機械力(壓力)激活電流所必需的，由Fam38B所編碼蛋白質(zhì)Piezo2，是響應(yīng)于背根神經(jīng)節(jié)(dorsalroot ganglion，DRG)神經(jīng)元的機械刺激所必需的，二者共同組成了目前的Piezo離子通道家族。Piezo通道是對陽離子具有非選擇滲透性的大型跨膜蛋白，對Na+、K+、Ca2+、Mg2+全部滲透，但更偏向Ca2+[5-6]。Piezo1蛋白的結(jié)構(gòu)在冷凍電鏡下是一種類似三葉螺旋槳的三聚體，包括一個中央離子傳導(dǎo)孔模塊和3個高度彎曲的非平面結(jié)構(gòu)葉片[7]。每個葉片有9個重復(fù)的結(jié)構(gòu)單元，每個單元有4個跨膜螺旋，這些螺旋單元通過梁狀結(jié)構(gòu)連接到孔中，葉片梁結(jié)構(gòu)可能形成杠桿狀的分子內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，用于中心孔的長距離機械門控[8-10]。Piezo1在神經(jīng)細(xì)胞[11]、軟骨細(xì)胞[12]等多種細(xì)胞[13-15]中表達。Piezo1的機械敏感性不需要借助其他蛋白質(zhì)或第二信使信號激活[16]，對細(xì)胞感受力學(xué)方面的壓力和機械力門控非選擇性陽離子電流的產(chǎn)生至關(guān)重要。

3 機械力通過Piezo1對骨代謝的影響

代謝性骨病一般是由于先天或后天原因使機體正常骨代謝過程和生理狀態(tài)紊亂，導(dǎo)致骨生化代謝發(fā)生障礙，其中以骨質(zhì)疏松最為常見。骨質(zhì)疏松主要以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強度下降為主要特征，且骨質(zhì)疏松癥患者極易發(fā)生骨折。正常成人的骨骼中破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞處于一種動態(tài)平衡，使骨組織不斷更新以維持骨骼的強度和彈性；骨的動態(tài)平衡被破壞后會導(dǎo)致骨的丟失引起骨質(zhì)疏松[17-18]。骨作為承重器官，不斷受到來自身體內(nèi)部(肌肉)和外界(地球重力)力的影響[19]，該影響可增加骨骼強度[20-21]。缺乏機械力，如長期臥床和微重力環(huán)境下會減少骨量[22-23]。而Piezo1可以在生物體內(nèi)響應(yīng)機械力[24]，研究發(fā)現(xiàn)，Piezo的基因變化與機械力反應(yīng)、人類骨密度和骨折有關(guān)[25]，且Piezo1水平的降低與骨質(zhì)流失的增加關(guān)系密切[17]。所以Piezo1在骨組織中應(yīng)答機械力的潛在作用機制可以為改善骨代謝疾病提供參考。

3.1 機械力通過Piezo1影響間充質(zhì)干細(xì)胞分化的潛在機制

成骨細(xì)胞和骨髓脂肪細(xì)胞起源于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)。而成骨與成脂過程“此消彼長”[26]。在骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)，BMSCs 向脂肪細(xì)胞分化能力增強，導(dǎo)致成骨分化和成脂分化的不平衡，骨折的風(fēng)險加大[27]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對機械應(yīng)力的刺激十分敏感。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2 (extracellular regulated protein kinases l/2，ERK1/2)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)通路可響應(yīng)施加在脂肪干細(xì)胞 (adipose-derived stem cells，ADSCs)上的機械拉伸并將它轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)成骨信號[28]。

研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1在MSCs中介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[29]。Piezo1在MSCs中作為靜水壓(hydrostatic pressure，HP)刺激的感受體來激活ERK1/2和p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP2)表達，增加成骨細(xì)胞分化、減少成脂細(xì)胞分化。BMP2是成骨細(xì)胞從MSCs分化的重要生長因子[30]，而阻斷BMP2功能可抑制HP誘導(dǎo)的成骨標(biāo)記基因表達。使用 Yoda1(Piezo1特異性激活劑)刺激MSCs時成脂分化減弱，成骨細(xì)胞分化增強。MEK和p38 MAPK抑制劑會抑制HP和Yoda1誘導(dǎo)的BMP2表達。機械力的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要ERK1/2信號通路的激活[31]，所以ERK1/2和p38 MAPK可能在HP-Piezo1-BMP2表達中起信號分子的作用。在大鼠牙髓細(xì)胞中，ERK1/2 在低強度脈沖超聲處理后24 h被激活，但釕紅(離子通道阻滯劑)可以抑制ERK1/2的激活[32]。人類牙髓來源的MSCs(human dental pulp stem cells，HDP-MSCs)經(jīng)過短時間的Yoda1刺激使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，但是Yoda1誘導(dǎo)的Ca2+反應(yīng)被Piezo1通道抑制劑以及Piezo1特異的siRNA抑制[33]。該研究認(rèn)為，Piezo1通道被激活可以誘導(dǎo)ATP釋放、P2受體嘌呤信號傳導(dǎo)，以及下游信號通路PYK2和MEK/ERK的傳導(dǎo)來促進MSC遷移，為調(diào)節(jié)MSC遷移的分子和信號機制提供新的見解。巧合的是，Piezo1在MC3T3-E1成骨細(xì)胞的遷移過程中作用巨大，敲除該細(xì)胞中Piezo1基因?qū)⒂绊懫溥w移能力[34]。

3.2 機械力通過Piezo1調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞平衡的潛在機制

骨的發(fā)生和生長包含成骨和破骨同時進行，成骨細(xì)胞不斷分化成熟形成新骨質(zhì)，破骨細(xì)胞分泌酸性物質(zhì)和蛋白酶來吸收舊骨質(zhì)，使骨化中心向四周擴展，骨質(zhì)不斷重建，骨組織體積增加[35-36]。二者的變化使凈骨量發(fā)生動態(tài)變化，所以平衡成骨-破骨過程至關(guān)重要。有趣的是，多個研究發(fā)現(xiàn)，機械載荷刺激成骨細(xì)胞系導(dǎo)致機械敏感陽離子Piezo1表達產(chǎn)生差異[37-39]。

3.2.1機械力通過Piezo1刺激YAP1和TAZ控制成骨細(xì)胞Wnt1表達：Hippo信號途徑的激酶鏈內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共激活因子 YAP(yes-associated protein，YAP)和類似物 TAZ(transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ)在成熟的成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞中可以通過促進骨形成并抑制骨吸收的方式調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[40]。在小鼠的成骨分化過程中YAP1/TAZ表達增加，且骨形成相關(guān)因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor 2，Runx-2)、骨鈣素、骨橋蛋白等表達也相應(yīng)增加[41]，而Piezo1能夠調(diào)節(jié)YAP的核定位[42]。

成骨細(xì)胞中Piezo1敲除的小鼠在出生3 d后即出現(xiàn)多處骨折，并且表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松、骨量明顯減少等變化。尾部懸吊導(dǎo)致對照小鼠遠端股骨骨量丟失，Piezo1基因敲除小鼠則沒有該表現(xiàn)；該處理增加了對照小鼠的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)表達，Piezo1基因敲除小鼠同樣沒有該表現(xiàn)，這顯示Piezo1基因敲除的小鼠對后肢卸載導(dǎo)致的骨丟失有一定抵抗力。該實驗中對Piezo1敲除和對照小鼠的BMSCs衍生的成骨細(xì)胞進行機械壓縮干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)Piezo1通過YAP促進Ⅱ型膠原酶(collagenase Ⅱ，COL2)和Ⅸ型膠原酶(collagenase Ⅸ，COL9)的表達，這些膠原酶抑制破骨細(xì)胞活性，所以機械力刺激Piezo1后通過YAP調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡[43]。在培養(yǎng)的骨細(xì)胞中由流體剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的Piezo1基因表達增加，而 Yoda1對Piezo1的刺激可以模擬流體剪切應(yīng)力對骨細(xì)胞的影響。向成年小鼠給藥Yozo1增加了骨量，模擬了機械負(fù)荷的影響。該實驗還進一步證明了在骨組織中Piezo1通過YAP1/TAZ控制Wnt1表達，流體剪切應(yīng)力通過刺激Piezo1來影響Wnt1和rankl表達，控制成骨或者破骨通路[21]。Wnt1通過增加細(xì)胞核內(nèi)的β-連環(huán)蛋白(Beta catenin，β-catenin)來提高骨形成相關(guān)因子Runx2的水平，增加成骨細(xì)胞的分化[44-45]。所以，在小鼠體內(nèi)，機械刺激通過Piezo1控制成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的平衡來調(diào)節(jié)骨量。

3.2.2機械力通過Piezo1控制成骨細(xì)胞中CaMKⅡ/Creb表達：骨骼細(xì)胞(骨吸收和骨形成)的協(xié)調(diào)功能維持鈣化組織(即骨)的穩(wěn)態(tài)，鈣化組織既儲存鈣又控制細(xì)胞外Ca2+的濃度[46]。Ca2+在骨骼細(xì)胞的調(diào)節(jié)中充當(dāng)關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)第二信使[47]，Ca2+的涌入可能導(dǎo)致CaMKⅡ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ)磷酸化并激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，Creb)途徑，從而促進成骨細(xì)胞分化[48-49]。

在成骨細(xì)胞中敲除Piezo1的小鼠成年后發(fā)育遲緩，出現(xiàn)嚴(yán)重的骨發(fā)育缺陷。后肢懸吊的實驗中，對比未干預(yù)小鼠懸吊小鼠的小梁骨礦物質(zhì)密度等指標(biāo)均明顯降低，而Piezo1敲除小鼠則沒有上述表現(xiàn)。同樣證明了Piezo1敲除小鼠對機械卸載導(dǎo)致的骨質(zhì)量和結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)變化具有一定抵抗力。并且將正常的骨細(xì)胞放在低重力模擬器中(模仿太空飛行)或使小鼠處于模仿臥床休息的條件下Piezo1表達下調(diào)。機械負(fù)荷刺激使對照小鼠Piezo1的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著增加，并伴隨著成骨細(xì)胞功能標(biāo)記基因表達的增加，而敲除小鼠沒有該變化。利用流體剪切力刺激成骨細(xì)胞也得到了在體實驗機械干預(yù)相似的結(jié)果[19]。Piezo1還可以使成骨細(xì)胞CaMKⅡ/Creb信號通路激活，導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化增加，而Piezo1敲除小鼠成骨細(xì)胞中CaMKⅡ和Creb的磷酸化水平降低，且伴隨著Runx2和激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor-4，ATF4)的蛋白表達表達降低，成骨分化受損[19]。這表明Piezo1是感受力刺激的響應(yīng)靶點，在Piezo1缺失后不會對力刺激做出相應(yīng)的反應(yīng)；且會通過CaMKⅡ/Creb信號通路影響成骨分化。

3.2.3機械力通過Piezo1控制成骨細(xì)胞AKT表達：絲氨酸/蘇氨酸激酶 AKT信號傳導(dǎo)在多種細(xì)胞代謝、細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長和分化途徑中具有關(guān)鍵作用[50]。骨細(xì)胞中硬化蛋白(Sclerostin，Sost)減少使Wnt/β-catenin 信號通路得到激活，促進骨形成[51]，且Sost可以參與機械刺激的成骨作用[52]，尾部懸吊小鼠血清中的Sost水平增加，而機械負(fù)荷抑制了該表達[53]。

Piezo1激動劑Yoda1增加了細(xì)胞內(nèi)鈣動員，并劑量依賴性地降低了鼠類骨細(xì)胞系IDG-SW3中Sost的表達。對IDG-SW3細(xì)胞進行機械拉伸抑制了Sost的表達，這一結(jié)果被GsMTx4干預(yù)以及Piezo1基因沉默所逆轉(zhuǎn)。此外，通過用Akt抑制劑治療消除了機械拉伸對Sost表達的抑制[54]。這表示Piezo1可能通過AKT調(diào)節(jié)Sost的表達。另一項研究中，在成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞中Piezo1受到流體切應(yīng)力的刺激表達升高，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞關(guān)鍵基因Runx-2的表達。然而，使用小干擾RNA沉默Piezo1后則不會出現(xiàn)上述結(jié)果，且機械力刺激AKT/GSK-3β/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的效果被抑制[55]。這表示在MC3T3-E1細(xì)胞系中，Piezo1作為感受器感受外部機械力(流體剪切應(yīng)力)的刺激，誘導(dǎo)AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的激活，促進成骨細(xì)胞Runx-2基因表達。

3.3 機械力通過Piezo1調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的潛在機制

關(guān)節(jié)軟骨是密集的結(jié)締組織，排列在關(guān)節(jié)表面上，為關(guān)節(jié)承受負(fù)荷提供降低摩擦[56]。軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中存在的唯一細(xì)胞單元，承載來自內(nèi)部(牽張力、剪切力)和外部(機械應(yīng)力)力的刺激，而軟骨受到破壞使軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，或者受到炎癥影響產(chǎn)生相關(guān)的增生，則會造成膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

將Piezo1特異的siRNA轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞中以沉默Piezo1表達。然后，使用循環(huán)拉伸應(yīng)變(cyclic tensile strain，CTS)施加至沉默和對照處理的細(xì)胞8 h。在Ca2+成像系統(tǒng)中檢查到拉伸刺激誘發(fā)的軟骨細(xì)胞中Ca2+的特性取決于拉伸強度，轉(zhuǎn)染siRNA使Piezo1基因沉默后的細(xì)胞拉伸誘發(fā)的Ca2+變化得到了顯著抑制，這表明拉伸刺激后軟骨細(xì)胞的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要依賴于Piezo1[57]。但是也有研究認(rèn)為，Piezo1離子通道導(dǎo)致的鈣離子過載導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡[58]。小鼠成骨細(xì)胞敲除Piezo1導(dǎo)致出生后早期骨密度降低、自發(fā)性骨折發(fā)生率增加且影響次生海綿體，體內(nèi)尺骨加載實驗證實了骨細(xì)胞機械感覺需要 Piezo1。在軟骨細(xì)胞中Piezo1基因缺失的小鼠和上述成骨細(xì)胞中刪除Piezo1小鼠的表型相似。對原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞刪除Piezo1的小鼠軟骨細(xì)胞相關(guān)基因，如SRY相關(guān)高遷移率組基因9(SRY-related high mobility group-box gene 9，Sox9)和周期蛋白依賴激酶抑制因子1C(cyclin dependent kinase inhibitor 1C，Cdkn1c)發(fā)生變化。ATDC5軟骨細(xì)胞給予Yoda1刺激后可以觀察到Piezo1表達增加明顯，且流體力刺激顯著增加MC3T3-E1細(xì)胞Piezo1表達[59]。這些數(shù)據(jù)表明 Piezo1通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞相關(guān)因子表達影響軟骨內(nèi)骨化過程，這可能是Piezo1在治療骨代謝疾病的又一重要方向。

4 總結(jié)和展望

機械負(fù)荷可以增加骨量、上調(diào)骨密度。機械敏感陽離子通道蛋白Piezo1是連接外界機械負(fù)荷刺激與哺乳動物體內(nèi)生物信號的重要因子，可以作為骨感受機械刺激的傳感器，在骨代謝和骨骼重建方面發(fā)揮作用，為研究者繼續(xù)了解機械負(fù)荷刺激調(diào)控骨代謝和骨重建提出了新的思路，也為未來深入研究機械力刺激通過Piezo1改善骨科疾病提供了新的發(fā)展空間。