內(nèi)耳毛細胞靜纖毛高度調(diào)控分子機制

李娜娜，徐志剛

山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266237

毛細胞(hair cell)是動物內(nèi)耳中負責(zé)感知聽覺和平衡信息的感受器細胞，將負載聲音信息或平衡信息的機械能信號轉(zhuǎn)換為電信號，這個過程被稱為機械-電轉(zhuǎn)換(mechano-electrical transduction,MET)。每個毛細胞的上表面有大量指狀細胞突起，統(tǒng)稱為纖毛束(hair bundle)，由一根以微管蛋白為骨架的動纖毛(kinocilium)和多根以肌動蛋白為骨架的靜纖毛(stereocilia)組成(圖1(a))[1]。動纖毛在纖毛束的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，但對于機械-電轉(zhuǎn)換不是必需的，甚至在哺乳動物聽覺毛細胞發(fā)育后期退化掉[2-3]。靜纖毛組織成多排高度不同的階梯狀結(jié)構(gòu)，對于機械-電轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，機械-電轉(zhuǎn)換離子通道就位于較低幾排靜纖毛的頂部(圖1(b)和(c))[4-6]。

在靜纖毛之間以及靜纖毛與動纖毛之間有大量的細胞外連接把它們聯(lián)系起來[7-8]。在這些細胞外連接中，頂連接(tip link)聯(lián)系了較低排靜纖毛的頂端與其相鄰較高靜纖毛的側(cè)部(圖1(a)和(b))[7]。頂連接由兩個單次跨膜的鈣黏蛋白構(gòu)成，位于上端的是CDH23蛋白，位于下端的是PCDH15蛋白，二者的胞外部分相互結(jié)合，共同構(gòu)成了頂連接(圖1(c))[9-10]。在機械能信號的作用下，當(dāng)靜纖毛向較高一排的方向偏轉(zhuǎn)時，頂連接的張力增加，開啟位于頂連接下端附近的機械-電轉(zhuǎn)換離子通道，陽離子內(nèi)流，毛細胞去極化，最終產(chǎn)生感受器電位，完成機械-電轉(zhuǎn)換[11]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個蛋白定位于較低排靜纖毛頂部、頂連接下方，形成所謂的“MET復(fù)合物”，參與執(zhí)行機械-電轉(zhuǎn)換[12-13](圖1(c))。目前已知的MET復(fù)合物成分包括TMC1/2、LHFPL5、TMIE以及CIB2，它們與頂連接下端蛋白PCDH15的跨膜區(qū)或胞內(nèi)段結(jié)合[10,14-22]。

圖1 毛細胞纖毛束示意圖：(a)側(cè)面觀；(b)頂面觀；(c)不同蛋白復(fù)合物在靜纖毛中的相對位置

靜纖毛的階梯狀結(jié)構(gòu)對于毛細胞執(zhí)行其機械-電轉(zhuǎn)換功能非常重要。靜纖毛的高度受到嚴(yán)格調(diào)控，部分調(diào)控這一過程的蛋白已經(jīng)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[23-26]。本文將對靜纖毛高度調(diào)控的分子機制進行簡要介紹。

1 靜纖毛發(fā)育分為不同階段

靜纖毛的核心部分由纖維狀肌動蛋白(F-actin)束組成，這些纖維狀肌動蛋白的正末端(plus end)位于靜纖毛的頂部，負末端(minus end)位于靜纖毛的根部[1-4]。在發(fā)育過程中，毛細胞通過肌動蛋白在正端的聚合和負端的解聚調(diào)控靜纖毛的高度。靜纖毛發(fā)育過程最初是在雞耳蝸中利用掃描電鏡得到了詳細的觀察[27-30]。根據(jù)形態(tài)上的變化，靜纖毛發(fā)育可分為四個階段。第一階段(胚胎期第8天左右)，所有的毛細胞和支持細胞上表面都覆蓋著多根短的以肌動蛋白為骨架的微絨毛以及一根以微管蛋白為骨架的纖毛。第二階段(胚胎期8～12天)，位于毛細胞上表面中心位置的動纖毛在胚胎期第9天隨機移動到周邊，緊接著在胚胎期9～11天所有毛細胞的動纖毛重新定位到毛細胞的同一側(cè)。毛細胞上表面的微絨毛在這一時期發(fā)育成為靜纖毛并覆蓋整個上表面，隨后在胚胎期10～12天靠近動纖毛的靜纖毛漸次增加其高度，形成靜纖毛的階梯狀模式。第三階段(胚胎期13～16天)，通過增加肌動蛋白絲的數(shù)量，靜纖毛直徑顯著增加。靜纖毛高度保持不變，但其負端的肌動蛋白絲向下延伸進入胞體形成小根(rootlet)。因遠離動纖毛而沒有在上一階段延長并形成階梯狀結(jié)構(gòu)的靜纖毛會被重吸收，而動纖毛也在這一階段退化不見。第四階段(胚胎期17天至孵化)，靜纖毛再次延長并達到最終的高度。

哺乳動物毛細胞靜纖毛發(fā)育大體上遵循類似的規(guī)律[31-32]。對于小鼠內(nèi)毛細胞而言，靜纖毛初始延長(第二階段)發(fā)生于胚胎期18.5 天之前，這一階段頂回毛細胞最高一排(Row 1)靜纖毛的長度可達到3～4 μm。胚胎期18.5天到出生后4.5天對應(yīng)于靜纖毛發(fā)育的第三階段，在這一時期靜纖毛停止延長，直徑增加。之后進入第四階段，最高一排靜纖毛繼續(xù)延長，第二排(Row 2)靜纖毛反而變短，直到在出生后19.5天達到最終的高度，分別為6 μm和2 μm左右。

2 成熟靜纖毛僅在頂部發(fā)生肌動蛋白的更新

肌動蛋白絲在其兩個末端可以同時發(fā)生聚合和解聚，在正末端一般聚合速度大于解聚速度，負末端解聚速度大于聚合速度。當(dāng)正末端的凈聚合等于負末端的凈解聚時，肌動蛋白絲的長度保持穩(wěn)定，這樣一種模式被稱為“踏車(treadmill)模型”[33]。研究人員利用基因槍技術(shù)在毛細胞中過表達肌動蛋白-GFP，發(fā)現(xiàn)成熟靜纖毛核心肌動蛋白絲的更新也符合踏車模型，單根靜纖毛的纖維狀肌動蛋白骨架每2～3天就全部更新一次[34-35]。

隨后多個實驗室利用多同位素質(zhì)譜成像、活細胞成像、轉(zhuǎn)基因小鼠等工具發(fā)現(xiàn)成熟靜纖毛的肌動蛋白骨架相當(dāng)穩(wěn)定，肌動蛋白的更新僅在靜纖毛頂部發(fā)生[36-38]。這些實驗結(jié)果表明靜纖毛是一個相當(dāng)穩(wěn)定的亞細胞結(jié)構(gòu)。最近又有報道指出，較低幾排靜纖毛頂部肌動蛋白的更新較最高一排靜纖毛更快，可能與在較低排靜纖毛頂部附近發(fā)生的機械-電轉(zhuǎn)換有關(guān)[39]。

3 Row 1和Row 2蛋白復(fù)合物調(diào)控靜纖毛高度

研究顯示特定蛋白在靜纖毛高度調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。在胚胎期毛細胞中，MYO15A-S和EPS8定位于所有靜纖毛的頂部[40]。在出生后及成年毛細胞中，MYO15A-S和EPS8主要定位在最高一排靜纖毛頂部，并將GPSM2/GNAI/WHRN三元復(fù)合體運輸?shù)酵瑯游恢?，共同形成所謂的“Row 1蛋白復(fù)合物”[32,40](圖1(c))。在小鼠中敲除不同Row 1蛋白編碼基因會引起相似的表型，主要表現(xiàn)為靜纖毛排數(shù)增多，高度變短且不同排之間高度差異減小(圖2(a)和(b))[41-45]。

在較低兩排(亦即有機械-電轉(zhuǎn)換功能)的靜纖毛頂端定位有另外一個蛋白復(fù)合物，稱作Row 2蛋白復(fù)合物，成員包括MYO15A-L、EPS8L2、TWF2、CAPZB2及BAIAP2L2[46-52](圖1(c))。在這一復(fù)合物中，EPS8L2、TWF2和CAPZB2有加帽蛋白(capping protein)的活性，被認(rèn)為發(fā)揮了抑制肌動蛋白聚合，從而限制靜纖毛高度的作用[46-48,50]。在小鼠中敲除Row 2蛋白編碼基因會引起較低兩排靜纖毛的退化，對最高排靜纖毛影響較小(圖2(a)和(c))[48-49,51-52]。此外，有研究顯示ESPNL也在較低排靜纖毛頂部高表達，其編碼基因敲除后引起最低一排靜纖毛退化[53]，而且體外實驗表明ESPNL能夠結(jié)合BAIAP2L2[51]，提示ESPNL可能也是Row 2蛋白復(fù)合物的成員。

圖2 Row 1和Row 2蛋白復(fù)合物缺失時對靜纖毛發(fā)育及維持的影響

4 機械-電轉(zhuǎn)換影響靜纖毛高度

前文已經(jīng)講過MET蛋白復(fù)合物定位于較低幾排靜纖毛的頂部，與Row 2蛋白復(fù)合物的位置接近(圖1(c))。與此相應(yīng)，研究顯示機械-電轉(zhuǎn)換會影響靜纖毛的高度[32,39,54]。用阻斷MET通道或破壞頂連接的藥物處理體外培養(yǎng)的聽覺感覺上皮，會導(dǎo)致毛細胞較低兩排靜纖毛高度減小；去除藥物后這一表型得到恢復(fù)[54]。用胞內(nèi)鈣離子螯合劑處理得到類似的結(jié)果，提示這一過程可能與鈣離子通過MET通道的內(nèi)流有關(guān)[54]。

基因敲除小鼠為MET蛋白調(diào)控靜纖毛高度提供了進一步的證據(jù)。Tmc1/Tmc2雙敲和Tmie敲除小鼠靜纖毛的表型類似，主要表現(xiàn)為不同排靜纖毛高度及直徑差異減小[32]。但二者之間也有一些細微的差異，如Tmc1/Tmc2雙敲小鼠毛細胞最高一排靜纖毛的高度不變，但Tmie敲除小鼠毛細胞最高一排靜纖毛高度減小[32]。體外實驗顯示成熟毛細胞中肌動蛋白在不同排靜纖毛頂部聚合速度不同：在最高一排聚合較慢，在較低兩排聚合較快[39]。然而在藥物阻斷MET或Tmie敲除小鼠毛細胞中，不同排靜纖毛頂部聚合速度趨向一致[39]。

LHFPL5和CIB2對靜纖毛高度的影響還沒有被詳細報道過，但根據(jù)已發(fā)表的掃描電鏡結(jié)果來看，Lhfpl5敲除小鼠和Cib2敲除小鼠呈現(xiàn)出較低排靜纖毛退化的趨勢[14,16,19]，與Tmc1/Tmc2雙敲及Tmie敲除小鼠靜纖毛的表型并不一致。這一結(jié)果提示我們，除了影響鈣離子內(nèi)流外，不同的MET蛋白可能通過不同的方式影響靜纖毛高度。與這一設(shè)想一致，最近我們發(fā)現(xiàn)MET復(fù)合物蛋白CIB2可以結(jié)合Row 2復(fù)合物蛋白BAIAP2L2，而且BAIAP2L2在Cib2敲除小鼠中不再定位于較低兩排靜纖毛頂端，表明CIB2可能通過BAIAP2L2直接調(diào)控較低排靜纖毛的高度[52]。這一模式能否擴展到其他MET蛋白和Row 2蛋白，還有待進一步的研究。

5 展望

成熟毛細胞的靜纖毛組織成多排高度不同的階梯狀結(jié)構(gòu)，這對于機械-電轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，靜纖毛形態(tài)、結(jié)構(gòu)的異常往往會引起耳聾和前庭功能受損[23]。目前我們對靜纖毛高度調(diào)控的分子機制已經(jīng)有了一定的認(rèn)識，如：成熟毛細胞的靜纖毛相當(dāng)穩(wěn)定，其核心肌動蛋白絲的更新往往只在頂部發(fā)生；特定蛋白定位于靜纖毛的頂部，調(diào)控不同排靜纖毛的高度；機械-電轉(zhuǎn)換可以影響靜纖毛的高度；等等。然而，Row 1、Row 2蛋白復(fù)合物以及機械-電轉(zhuǎn)換調(diào)控靜纖毛高度的具體機制目前還不是十分清楚，在這一過程中可能還有其他發(fā)揮重要作用的蛋白有待發(fā)現(xiàn)。

本文主要關(guān)注的是毛細胞靜纖毛高度調(diào)控的分子機制。除了高度調(diào)控之外，關(guān)于靜纖毛發(fā)育和維持還有很多重要問題亟待回答。例如，靜纖毛直徑調(diào)控的分子機制是什么？毛細胞中靜纖毛的排數(shù)是如何控制的？此外，毛細胞平面細胞極性(planar cell polarity, PCP)的確立對聽覺和平衡功能至關(guān)重要，在亞細胞水平體現(xiàn)為靜纖毛和動纖毛的不對稱分布。這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了很多重要的進展，發(fā)現(xiàn)了多個調(diào)控PCP的重要蛋白，但仍有很多細節(jié)和關(guān)鍵問題有待深入探討[55-57]。