鳥綱類生物雞用于耳蝸毛細(xì)胞再生領(lǐng)域研究進(jìn)展

萬良財

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院耳鼻咽喉科(廣州 510282)

上世紀(jì)80年代，Cruz等為研究氨基糖苷類抗生素的耳毒性，以雞耳蝸為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)雞耳蝸毛細(xì)胞在損傷后，具有較強(qiáng)自發(fā)再生能力，并因此開創(chuàng)了內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的新紀(jì)元[1]。此后，耳蝸毛細(xì)胞再生研究一直是耳科學(xué)界的熱點。雞作為鳥綱類動物的代表，因具有易于繁殖、胚胎期短、耳蝸取材方便及毛細(xì)胞再生能力較強(qiáng)等優(yōu)點，一直是研究內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的理想動物之一。本文對雞耳蝸模型用于內(nèi)耳毛細(xì)胞再生領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展綜述如下。

1 雞耳蝸解剖

雞耳蝸與哺乳動物耳蝸的外形大不相同，但功能相似，它是一條短而彎曲呈香蕉狀的管，由三部分組成：聽壺，屬前庭器官，與位覺斑相似；血管蓋，構(gòu)成蝸管上壁及部分側(cè)壁，其間富含血管；聽覺感受器又稱基底乳頭(basilar papilla,BP)，呈鐮刀狀，位于上、下軟骨板之間，由基底膜、毛細(xì)胞、支持細(xì)胞構(gòu)成。BP由近端向遠(yuǎn)端逐漸增寬，近端尖銳，遠(yuǎn)端圓鈍，凸側(cè)為神經(jīng)緣，凹側(cè)稱非神經(jīng)緣。其表面的毛細(xì)胞呈馬賽克圖案樣排列，毛細(xì)胞分為兩種類型，即高毛細(xì)胞與矮毛細(xì)胞?？拷窠?jīng)部的毛細(xì)胞稱為高毛細(xì)胞，呈柱狀?？拷巧窠?jīng)部的毛細(xì)胞稱為矮毛細(xì)胞。高毛細(xì)胞類似于哺乳動物耳蝸的內(nèi)毛細(xì)胞，而矮毛細(xì)胞則類似于哺乳動物耳蝸的外毛細(xì)胞，支持細(xì)胞有助于保持基底乳頭結(jié)構(gòu)的完整性，維持網(wǎng)狀層離子屏障，以及新毛細(xì)胞的產(chǎn)生[2]。

2 雞耳蝸毛細(xì)胞損傷與再生研究

2.1 雞耳蝸毛細(xì)胞損傷模型的建立

2.1.1 噪聲性聾模型

Cotanche等最早利用10日大的雛雞暴露于聲壓級120 dB SPL的1500 Hz純音環(huán)境48小時構(gòu)建噪聲性聾模型，在暴露后0 h，24 h，48 h，4 d，6 d和10d對其耳蝸進(jìn)行透射和光學(xué)顯微鏡處理。研究發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞損傷呈現(xiàn)出兩種類型，第一種損傷毛細(xì)胞完全喪失，第二種毛細(xì)胞存活但表現(xiàn)出不同程度的靜纖毛損傷。噪聲暴露48小時后，在毛細(xì)胞喪失區(qū)域即出現(xiàn)新的毛細(xì)胞。暴露后10天，損傷毛細(xì)胞基本恢復(fù)[3]。此后，根據(jù)不同試驗需求，Co?tanche又將噪聲性聾毛細(xì)胞損傷分為中等程度與嚴(yán)重程度。以1500 Hz，120 dB SPL噪聲暴露24小時或以900 Hz，120 dB SPL噪聲暴露48小時可引起毛細(xì)胞中等程度損傷，即毛細(xì)胞損傷而不造成支持細(xì)胞損傷；而以1500 Hz，123 dB SPL噪聲暴露24小時或900 Hz 124 dB SPL噪聲暴露24小時不僅造成毛細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，同時也可造成支持細(xì)胞嚴(yán)重受損，即嚴(yán)重噪聲性損傷[4]。Kurian等利用噪聲暴露模型來研究毛細(xì)胞噪聲刺激后靜纖毛尖端連接改變，實驗時雛雞予0.9 kHz，120 dB SPL純音噪聲分別暴露4小時，24小時或48小時。研究發(fā)現(xiàn)矮毛細(xì)胞上靜纖毛尖端連接損失分別為30.3、40.6和35.5%。暴露48小時的雛雞予恢復(fù)24、96或288小時后，尖端連接可恢復(fù)至對照水平。高毛細(xì)胞尖端連接喪失與恢復(fù)與矮毛細(xì)胞類似[5]。Sliwinska-Kowalska等予120 dB SPL，每天暴露8小時，連續(xù)五天，或120 dB SPL連續(xù)暴露72小時成功構(gòu)建了雞耳蝸毛細(xì)胞損害模型。研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度噪音暴露可造成基底乳頭中部及近端毛細(xì)胞損壞，在基底乳頭中部毛細(xì)胞胞漿，支持細(xì)胞胞核和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿中均免疫表達(dá)生長因子bFGF及NGF[6]。

2.1.2 氨基糖甙類耳毒性模型

雖然氨基糖甙類藥物耳毒性機(jī)制目前尚不清楚，但予其制作耳毒性模型已廣泛應(yīng)用于聽力學(xué)實驗研究。Xiang等為了探討新生毛細(xì)胞有抗硫酸卡那霉素耳毒性作用，對3日大小雛雞每天肌注硫酸卡那霉素（200 mg/kg），連續(xù)10-30日構(gòu)建體外耳蝸毛細(xì)胞損傷模型，予掃描電子顯微鏡檢查基底乳頭。研究發(fā)現(xiàn)，基底乳頭新再生的不成熟的毛細(xì)胞具有一定的抗耳毒性能力，但隨著毛細(xì)胞的發(fā)育成熟則逐漸喪失了這種能力[7]。Shang等為了研究在耳蝸毛細(xì)胞損傷后，支持細(xì)胞是如何轉(zhuǎn)化為新生毛細(xì)胞的，體內(nèi)試驗通過對5～10日大小的雛雞連續(xù)兩日皮下注射慶大霉素（250 mg/kg）；而體外試驗，以含78 μM鏈霉素DMEM或BME/EBSS培養(yǎng)基培養(yǎng)基底乳頭1～12日構(gòu)建毛細(xì)胞損傷模型。研究表明，體內(nèi)體外試驗，支持細(xì)胞有絲分裂和毛細(xì)胞分化的時間進(jìn)程是類似的，支持細(xì)胞直接分化成毛細(xì)胞是毛細(xì)胞再生的一重要機(jī)制[8]。為了探討B(tài)MP4在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的作用，Lewis對7～10日大小的雛雞基底乳頭予含鏈霉素（172μM）DMEM體外培養(yǎng)，成功構(gòu)建毛細(xì)胞損傷模型。研究發(fā)現(xiàn)，在毛細(xì)胞受損基底乳頭，BMP4可以抑制毛細(xì)胞再生，其原因可能是由于BMP4可以阻止ATOH1在支持細(xì)胞的聚集[9]。Jiang為研究毛細(xì)胞再生所涉及的候選基因和信號通路提供一個相對完整的數(shù)據(jù)庫，通過對6至8天大小的雛雞連續(xù)皮下注射慶大霉素(0.25 mg/g)兩天，造耳蝸毛細(xì)胞受損模型，通過RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在實驗組與對照組耳蝸，共發(fā)現(xiàn)有16588個基因表達(dá)，在注射后第3日，發(fā)現(xiàn)有805個差異表達(dá)基因[10]。最近，Wan等為了研究VEGF在耳蝸毛細(xì)胞再生中的作用，依據(jù)實驗不同，予含鏈霉素（172μM或1mM）兩種濃度DMEM培養(yǎng)4～11日大小的雛雞基底乳頭1～2天成功構(gòu)建毛細(xì)胞喪失體外模型，研究表明，這兩種濃度在1～2日均幾乎可破壞全部毛細(xì)胞。支持細(xì)胞有絲分裂大多發(fā)生在開始給藥后的2～4日，少量新生毛細(xì)胞在開始給藥后的3～4日，至給藥后第8日，約有1/3再生毛細(xì)胞出現(xiàn)，此后，隨著時間延長，再生毛細(xì)胞數(shù)量可恢復(fù)至正常水平[11]。

2.1.3 鉑類藥物耳毒性模型研究

眾所周知，鉑類藥物具有耳毒性，予鉑類藥物制作耳毒性模型已用于鼠類及斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞再生研究[12-14]。能否用順鉑來構(gòu)建雞耳蝸毛細(xì)胞再生研究模型呢？Eric等予含10-20 μM順鉑培養(yǎng)基來孵育基底乳頭24小時，予3 μg/ml BrdU來監(jiān)測支持細(xì)胞有絲分裂，發(fā)現(xiàn)基底乳頭毛細(xì)胞損害最早發(fā)生在遠(yuǎn)端低頻區(qū)，從近端高頻區(qū)至遠(yuǎn)端低頻區(qū)呈現(xiàn)一漸近加重獨特的調(diào)亡壞死模式。研究認(rèn)為，支持細(xì)胞因治療后發(fā)生裂解調(diào)亡，不能通過增生或直接分化的方式而再生出新的毛細(xì)胞[15]。

2.2 雞耳蝸再生毛細(xì)胞的來源

Cotanche早期研究發(fā)現(xiàn)，在基底乳頭毛細(xì)胞受損后，支持細(xì)胞和排列在聽覺上皮非神經(jīng)緣的透明細(xì)胞可以吸收外源核苷酸并進(jìn)入S期，因此，認(rèn)為這兩種細(xì)胞有可能是再生毛細(xì)胞的前體細(xì)胞。但隨后又排除了透明細(xì)胞作為再生毛細(xì)胞前體細(xì)胞的可能，因為透明細(xì)胞增殖和遷移到毛細(xì)胞受損區(qū)域后并不會形成新的毛細(xì)胞[4]。此后越來越多的研究者認(rèn)為，在雞等鳥綱類動物，正常組織更新或毛細(xì)胞損害后產(chǎn)生新毛細(xì)胞的祖細(xì)胞是支持細(xì)胞[16]。Roberson在毛細(xì)胞再生的整個過程中加入3H-胸苷或溴脫氧尿苷，大量新再生的毛細(xì)胞并未標(biāo)記3H-胸苷或溴脫氧尿苷，這說明這些未標(biāo)記3H-胸苷或溴脫氧尿苷新再生的毛細(xì)胞并不是通過有絲分裂的方式轉(zhuǎn)化而來的[17]。此后，Stone課題組研究亦發(fā)現(xiàn)，正常情況下，基底乳頭不會出現(xiàn)增殖，但在毛細(xì)胞損害或消失后，支持細(xì)胞會再次進(jìn)入S-階段和分裂。雞基底乳頭毛細(xì)胞再生是干細(xì)胞所驅(qū)動的過程，毛細(xì)胞可以通過支持細(xì)胞分裂增殖產(chǎn)生，也可通過支持細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換（亦稱為“直接分化”或“非有絲分裂”）而產(chǎn)生。雖然有絲分裂和直接分化可以同時發(fā)生，但基底乳頭非神經(jīng)部區(qū)域優(yōu)先以直接分化再生新的毛細(xì)胞，在此區(qū)域約三分之一新再生的毛細(xì)胞表達(dá)溴脫氧尿苷（BrdU），亦即認(rèn)為僅三分之一新再生的毛細(xì)胞是通過支持細(xì)胞有絲分裂而來的。支持細(xì)胞直接分化成毛細(xì)胞是毛細(xì)胞再生的一重要機(jī)制[8,18]。

2.3 雞耳蝸再生毛細(xì)胞的生理功能

為了研究再生毛細(xì)胞聽功能恢復(fù)情況，不同研究者對新生毛細(xì)胞畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)、聽性腦干反應(yīng)(ABR)及瞬態(tài)鈣離子電流等進(jìn)行研究。Trautwein將雛雞暴露于525Hz純音，120dB SPL，48小時，比較暴露前后的DPOAE。研究表明，噪聲暴露不僅導(dǎo)致大量毛細(xì)胞喪失，還導(dǎo)致了基底乳頭神經(jīng)部從低頻至中頻區(qū)域蓋膜破壞，雖然病變范圍局限，但DPOAEs所有頻率幅值在暴露后立即明顯降低。此后，高頻DPOAE可逐漸恢復(fù)到暴露前水平[19]。李勝利等對出生后16～20日雛雞按50mg/(Kg/d)肌注慶大霉素共10日后，間隔1、3、6、9和12日對雞耳蝸電位及聽覺腦干誘發(fā)電位進(jìn)行測定。研究發(fā)現(xiàn)，在毛細(xì)胞損傷初期，耳蝸電位及聽覺腦干誘發(fā)電位明顯升高達(dá)80 SPL dB，但在慶大霉素注射9～12日，再生毛細(xì)胞已基本發(fā)育成熟，耳蝸電位及聽覺腦干誘發(fā)電位亦基本正常,說明毛細(xì)胞再生在聽功能恢復(fù)中起重要作用[20]。Ipakchi通過對雛雞及成年雞對比研究發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)噪聲暴露后，它們的耳蝸結(jié)構(gòu)和功能都受到嚴(yán)重?fù)p害。對于雛雞，噪聲暴露雖會造成內(nèi)耳損傷，在暴露后12天DPOAE完全恢復(fù)，暴露后2-4周，能恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的蝸內(nèi)電位；但在成年雞，噪聲暴露對蝸內(nèi)電位幾乎沒有影響，DPOAE在暴露后12天幾乎沒有恢復(fù)。研究認(rèn)為，對于雛雞，12天足以充分修復(fù)內(nèi)耳損傷，徹底恢復(fù)正常的DPOAE[21]。Levic等認(rèn)為再生的毛細(xì)胞如要有正常毛細(xì)胞的生理功能，就必須要有正常的突觸和適度的離子電流表達(dá)。為了明確再生的毛細(xì)胞如何在成熟耳蝸中確立其功能生態(tài)位，Levic予慶大霉素治療后雞動物模型，誘導(dǎo)基底乳頭底部約1/3毛細(xì)胞損害。研究發(fā)現(xiàn)與成熟的毛細(xì)胞相比，新再生細(xì)胞可表現(xiàn)出與正常成熟毛細(xì)胞類似的瞬態(tài)鈣離子電流，這種電流在慶大霉素治療后7天再生的毛細(xì)胞最為明顯，且這種瞬態(tài)鈣離子電流可以誘導(dǎo)自發(fā)動作電位的產(chǎn)生[22]。

2.4 雞耳蝸毛細(xì)胞再生相關(guān)的基因及信號通路

通過研究終生具有再生功能的雞聽覺毛細(xì)胞的再生機(jī)制，有助于為哺乳動物尋找有效的干預(yù)靶點，解除阻斷毛細(xì)胞再生的機(jī)制，為最終解決哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞再生提供重要的借鑒意義。迄今為止，啟動雞內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的精確信號機(jī)制尚不清楚，研究者普遍認(rèn)為內(nèi)耳毛細(xì)胞再生是一極其復(fù)雜的過程，涉及眾多的基因和信號通路，其中，Atoh1是被研究最多的轉(zhuǎn)錄因子，而Notch、EGFR、FGF、Wnt/b-catenin等信號通路一直是研究的熱點。

Cafaro等研究發(fā)現(xiàn)在基底乳頭毛細(xì)胞損害后，堿性螺旋環(huán)螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子Atoh1被激活，進(jìn)而進(jìn)一步激活支持細(xì)胞通過分化或有絲分裂再生出新的毛細(xì)胞[18]。Lewis等研究發(fā)現(xiàn)，在基底乳頭毛細(xì)胞受損后，支持細(xì)胞Atoh1表達(dá)明顯上調(diào)[23]。BMP4可拮抗雞基底乳頭的毛細(xì)胞再生，其可能原因是通過阻止Atoh1在毛細(xì)胞前體細(xì)胞中的聚集[9]。Mulvaney等通過對雞Atoh1(cAtoh1)及鼠Atoh1(hAtoh1)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在克服Sox2抑制毛細(xì)胞分化方面，cAtoh1比hAtoh1更有效，cAtoh1能有效促進(jìn)雞感覺毛細(xì)胞的分化[24]。Jiang研究發(fā)現(xiàn)，在基底乳頭毛細(xì)胞損害區(qū)域，支持細(xì)胞Atoh1表達(dá)上調(diào)；在毛細(xì)胞再生早期，支持細(xì)胞Sox2表達(dá)上調(diào)，但當(dāng)支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的毛細(xì)胞后，這種上調(diào)便停止[25]。Daudet認(rèn)為在正常雞基底乳頭，Notch信號通路相關(guān)基因如Notch1，Notch2與Ser?rate1 呈高表達(dá)，而Serrate2，Delta1，Atoh1，Hes5，Hes6，MINT和呈相對低表達(dá)，但當(dāng)毛細(xì)胞喪失后，支持細(xì)胞Hes5與Delta1呈高表達(dá)。抑制γ分泌酶能促進(jìn)Atoh1與Delta1的表達(dá)，降低Hes5的表達(dá)，這種改變并沒有明顯直接促進(jìn)支持細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行有絲分裂，但可促進(jìn)支持細(xì)胞直接分化成新的毛細(xì)胞[26]。

White予經(jīng)鏈霉素治療后的基底乳頭為研究對象，予AG1478抑制EGFR信號通路后，支持細(xì)胞有絲分裂明顯減少，且這種減少并不是因為支持細(xì)胞死亡而導(dǎo)致的。研究表明EGFR信號通路對促進(jìn)支持細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期十分重要，并有可能是通過下調(diào)p27Kip1而實現(xiàn)的[27]。Jacques以E5-E12大小基底乳頭為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育中的基底乳頭，Wnt/β-catenin信號被激活，基底乳頭所有上皮細(xì)胞均表達(dá)β-catenin。予IWR-1抑制Wnt信號通路能明顯抑制細(xì)胞增殖，相反，以LiCl激活Wnt/β-catenin信號通路則能顯著增加毛細(xì)胞的數(shù)量，研究表明，Wnt/β-catenin信號在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中起重要的作用[28]。楊思遠(yuǎn)等以7日大小雛雞為研究對象，以鏈霉素對體外培養(yǎng)的基底乳突造成毛細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，同時抑制Notch信號通路，激動Wnt信號通路，可使毛細(xì)胞的再生效果達(dá)到最佳狀態(tài)[29]。

近年來，為了從生物信息學(xué)角度來闡明內(nèi)耳毛細(xì)胞再生機(jī)制，研究者應(yīng)用RNA-Seq，cDNA微陣列等不同方法，調(diào)查雞內(nèi)耳毛細(xì)胞受損后轉(zhuǎn)錄譜的改變[10,30]。Jiang通過對基底乳頭毛細(xì)胞再生過程中的基因表達(dá)進(jìn)行高通量基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄組分析，研究發(fā)現(xiàn)雞耳蝸表達(dá)16,588個基因，其中在不同組別中有1000個差異表達(dá)基因，這些基因涉及包括在胚胎發(fā)育過程中起重要作用的如Notch,MAPK(FGF),Wnt和TGF-b(BMP)等約100條信號通路，這為研究毛細(xì)胞再生所涉及的候選基因和信號通路提供一個相對完整的數(shù)據(jù)庫[10]。最近，Wan等利用RNA-Seq方法，發(fā)現(xiàn)雞基底乳頭經(jīng)鏈霉素治療后，VEGF信號通路相關(guān)基因VEGFA,VEGFC,VEG?FR1，VEGFR2，VEGFR3表達(dá)上調(diào)，研究表明，在毛細(xì)胞受損后VEGF可以正向促進(jìn)毛細(xì)胞再生，但其具體機(jī)制尚不明確[11]。

3 雞耳蝸在感音神經(jīng)性聾的其它應(yīng)用研究

HUANJU等對胚胎雞基底乳頭予鏈霉素治療后發(fā)現(xiàn)，E12和E14胚胎雞基底乳頭毛細(xì)胞幾乎不受影響，E16和E18胚胎雞基底乳頭，毛細(xì)胞有中等程度的損害，神經(jīng)部的毛細(xì)胞對鏈霉素敏感，更易受到破壞。研究表明，與孵化后雞基底乳頭毛細(xì)胞不同，胚胎雞基底乳頭毛細(xì)胞對氨基糖苷類并不敏感，不易受到損害[31]。Tompkins以雞耳蝸毛細(xì)胞為研究對象，對尖端鏈接進(jìn)行了深入地研究，研究發(fā)現(xiàn)尖端鏈接是毛細(xì)胞機(jī)械電轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中必需的分子絲，尖端鏈接形成和靜纖毛長度控制是相耦合的。通過觀察各個尖端鏈接分子，并觀察它們?nèi)绾蜗嗷プ饔谩討B(tài)移動及觀察纖毛長度，深入地解釋了尖端鏈接的形成和異常鏈接修剪是如何發(fā)生的[32]。

4 小結(jié)

雞耳蝸因取材方便且毛細(xì)胞再生能力較強(qiáng)等優(yōu)點，近40年來一直是研究內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的理想動物之一。目前，雞耳蝸毛細(xì)胞損傷實驗造模方法已十分成熟，通常包括噪聲暴露造模、氨基糖甙類造模。廣大研究者以雞耳蝸毛細(xì)胞損傷模型，對再生毛細(xì)胞的前體細(xì)胞，再生毛細(xì)胞的生理功能及內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的信號機(jī)制進(jìn)行了深入地研究。自2011年以來，以美國聽力健康基金會（HHF）牽頭成立了第一個以研究內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的國際研究協(xié)會HRP(Hearing Restoration Project)，研究者分別以雞、鼠、斑馬魚三類不同動物為研究對象進(jìn)行內(nèi)耳毛細(xì)胞再生研究，比較不同物種內(nèi)耳毛細(xì)胞再生機(jī)制異同，他們分工協(xié)作，數(shù)據(jù)共享，取得了一系列的研究成果，并將內(nèi)耳毛細(xì)胞再生研究推向了一新的高度[11,33,34]。這也為雞作為研究耳聾的動物模型奠定了堅實的基礎(chǔ)，為豐富內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的內(nèi)容，闡明耳蝸毛細(xì)胞再生的分子機(jī)制及今后治療因耳蝸毛細(xì)胞損傷造成的感音神經(jīng)性耳聾提供重要的理論基礎(chǔ)。