啶蟲脒對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性作用

馬 躍，劉 芙，宋月清，柴琳青，王 鑫，袁 寧，馬明月*，毛亞萍*

0 引言

啶蟲脒(Acetamiprid，ACE)是煙堿型乙酰膽堿受體的選擇性激動(dòng)劑，是應(yīng)用最廣泛的新煙堿類殺蟲劑(Neonicotinoids，NEOs)之一[1]。NEOs在環(huán)境中的廣泛分布導(dǎo)致了人群的廣泛暴露，流行病學(xué)調(diào)查顯示，由于不同地區(qū)的飲食模式和殺蟲劑應(yīng)用不同，亞洲人群的尿中NEOs水平顯著高于美國(guó)和歐洲，其中N-去甲基啶蟲脒、5-羥基吡蟲啉和烯烴吡蟲啉在檢測(cè)到的NEOs中占主導(dǎo)地位[2]。NEOs的長(zhǎng)期累積暴露可對(duì)人類健康產(chǎn)生不良影響。近年來，NEOs對(duì)非靶向哺乳動(dòng)物的生殖毒性已引起人們的重點(diǎn)關(guān)注。多項(xiàng)研究報(bào)道了NEOs對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損害，導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物的睪丸重量下降，睪酮濃度及精子數(shù)量、活力顯著降低，以及精子受精能力降低等[3-5]。但目前關(guān)于ACE等NEOs對(duì)生殖系統(tǒng)毒性作用的研究較少，相關(guān)機(jī)制并不明確。本研究以ACE為研究對(duì)象，采用睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3，探究ACE的生殖細(xì)胞毒性作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供線索和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠TM3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑與儀器 ACE(純度≥98%)(MedChemExpress，中國(guó))，DMEM-F12培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó))，胎牛血清(FBS)(GIBCO，美國(guó))，PBS、100 U/ml青霉素-100 μg/ml鏈霉素(雙抗)(Hyclone，美國(guó))，CCK-8 Cell Counting Kit、Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit (諾唯贊，中國(guó))，Trizol(生工生物，中國(guó))，PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)、TB Green?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)。CO2培養(yǎng)箱、Nanodrop 核酸濃度測(cè)定儀、低溫高速離心機(jī)(Thermo，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Applied Biosystems，美國(guó))，多功能酶標(biāo)儀(Molecular Device，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 ACE處理TM3細(xì)胞 應(yīng)用DMEM-F12培養(yǎng)基(含10% FBS和1%雙抗)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)TM3細(xì)胞。稱取一定重量的ACE，用DMSO溶解，逐滴加入DMEM-F12培養(yǎng)基中(DMSO終濃度不超過0.5%)，配制的ACE濃度從1、10、100、1 000 μmol/L至1、2、4、6、8、10、12 mmol/L逐步提高濃度進(jìn)行摸索。棄去TM3細(xì)胞舊培養(yǎng)基，加不同濃度ACE溶液(含5%FBS和1%雙抗)處理，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 TM3細(xì)胞活力檢測(cè) 以適宜細(xì)胞量接種96孔板，待細(xì)胞量至70%～80%，加入1、2、4、6、8、10、12 mmol/L ACE處理24 h和48 h，每孔加入10 μl CCK8溶液，混勻后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，利用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率和IC50。根據(jù)24 h IC50設(shè)定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的ACE濃度。

1.2.3 TM3細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。以適宜細(xì)胞量接種6孔板，待細(xì)胞量至70%～80%，加入0、2、4、6、8 mmol/L ACE處理24 h。用不含EDTA的胰酶消化、收集細(xì)胞。用預(yù)冷PBS洗2次。將細(xì)胞重懸于100 μl 1×Binding Buffer中，加入5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI Staining Solution，混勻，室溫避光孵育10 min。同時(shí)設(shè)不加PI和Annexin V-FITC的陰性對(duì)照，以及PI和Annexin V-FITC單染的對(duì)照。加入400 μl 1×Binding Buffer，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率(%)=Q2+Q3，即晚期細(xì)胞凋亡率和早期細(xì)胞凋亡率之和。

1.2.4 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 以適宜細(xì)胞量接種6孔板，待細(xì)胞量至70%～80%，加入0、2、4、6、8 mmol/L ACE處理24 h。用Trizol 法提取總RNA，并應(yīng)用Nanodrop 進(jìn)行RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，用TB Green?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析。所用基因qPCR引物見表1。

表1 基因qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 ACE對(duì)TM3細(xì)胞活力的影響 在進(jìn)行ACE染毒濃度摸索中，發(fā)現(xiàn)ACE濃度達(dá)8 mmol/L時(shí)，可對(duì)TM3細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響。以1、2、4、6、8、10、12 mmol/L ACE處理TM3細(xì)胞24 h和48 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力在4、6、8、10、12 mmol/L隨ACE濃度升高而下降，且在8、10、12 mmol/L組，48 h細(xì)胞活力顯著低于24 h(P<0.01)，表明ACE可抑制TM3細(xì)胞活力，且呈濃度和時(shí)間依賴性。見圖1。計(jì)算24 h IC50為7.20 mmol/L，故后續(xù)ACE染毒濃度選擇為0、2、4、6、8 mmol/L。

圖1 ACE對(duì)TM3細(xì)胞活力的影響

2.2 ACE對(duì)TM3細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響 以0、2、4、6、8 mmol/L ACE處理TM3細(xì)胞24 h，qPCR檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)PCNA和Ki67的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 mmol/L組相比，6、8 mmol/L組PCNAmRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)，4、6、8 mmol/L組Ki67mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，表明ACE可抑制TM3細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。見圖2。

圖2 ACE對(duì)TM3細(xì)胞PCNA和Ki67表達(dá)的影響

2.3 ACE對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的影響 以0、2、4、6、8 mmol/L ACE處理TM3細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TM3細(xì)胞凋亡率隨ACE濃度升高而增加，且6、8 mmol/L組與0 mmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 ACE對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的影響

2.4 ACE對(duì)睪酮合成酶基因表達(dá)的影響 以0、2、4、6、8 mmol/L ACE處理TM3細(xì)胞24 h，qPCR檢測(cè)睪酮合成酶基因Star、Hsd3b1、Cyp11a1mRNA基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 mmol/L組相比，6、8 mmol/L組的Star和Hsd3b1mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Cyp11a1mRNA在所有劑量組的表達(dá)均高于0 mmol/L組(P<0.01)，表明ACE可以上調(diào)Star、Hsd3b1、Cyp11a1基因的表達(dá)。見圖4。

圖4 ACE對(duì)TM3細(xì)胞睪酮合成酶基因表達(dá)的影響

3 討論

ACE可選擇性作用于昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的煙堿型乙酰膽堿受體，發(fā)揮殺蟲作用，其在全球范圍內(nèi)被廣泛用于保護(hù)農(nóng)作物和寵物免受蟲害侵害，已經(jīng)成為銷售量增長(zhǎng)最快的一類殺蟲劑[6]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，ACE和吡蟲啉等在人群中檢出率較高，農(nóng)民、農(nóng)藥經(jīng)營(yíng)者及兒童均是高暴露人群[7-8]。盡管與傳統(tǒng)殺蟲劑相比，ACE被認(rèn)為對(duì)哺乳動(dòng)物毒性較低，但已有研究表明，ACE暴露可對(duì)哺乳動(dòng)物甚至人類造成潛在危險(xiǎn)[9-11]。

近年來，越來越多的研究利用動(dòng)物模型探究ACE對(duì)人類及哺乳動(dòng)物的生殖功能損害，但相關(guān)機(jī)制并不明確。因此，本研究在體外探究ACE對(duì)TM3細(xì)胞的毒性作用。因目前未見ACE對(duì)TM3細(xì)胞毒性作用的報(bào)道，我們探索了ACE處理TM3細(xì)胞24 h時(shí)的IC50(7.2 mmol/L)，據(jù)此，ACE暴露濃度選擇為0、2、4、6、8 mmol/L。ACE暴露濃度較高，可能是由于ACE對(duì)TM3毒性較低，或者是由于其在DMEM-F12培養(yǎng)基中溶解度較低而導(dǎo)致暴露濃度高。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE暴露可導(dǎo)致TM3細(xì)胞活力在高濃度組呈時(shí)間和濃度依賴性降低，而在2 mmol/L組細(xì)胞存活力略微上升，這可能是由于ACE的非單調(diào)劑量-效應(yīng)。非單調(diào)劑量-效應(yīng)在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的毒性研究中廣泛存在[12-13]。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞增殖指數(shù)基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCNA和Ki67mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)，表明ACE暴露可通過抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE暴露可導(dǎo)致TM3細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性升高，表明ACE暴露還可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。重要的是，在6、8 mmol/L組細(xì)胞存活率已降至50%左右，但細(xì)胞凋亡率卻低于20%，推測(cè)ACE可能主要通過抑制細(xì)胞增殖來影響細(xì)胞活力，相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步探究。ACE在體外抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的結(jié)果，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。Arcan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量ACE[25、35 mg/(kg·d)]暴露對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有一定的毒性作用，可導(dǎo)致雄性大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡增加，而PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯下降。Terayama等[15]探究了ACE對(duì)幼鼠睪丸的影響，ACE染毒180 d，發(fā)現(xiàn)小鼠體重下降，精子數(shù)量降低，并導(dǎo)致增殖相關(guān)基因Ki67和Top2a表達(dá)降低。因此，ACE對(duì)生殖細(xì)胞增殖的影響可能是ACE生殖毒性的重要機(jī)制，值得進(jìn)一步探究。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞是合成睪酮的重要場(chǎng)所，睪酮合成過程需要多種代謝酶的參與，首先由StAR調(diào)控膽固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜，位于線粒體內(nèi)膜的P450scc催化膽固醇轉(zhuǎn)變成為孕烯醇酮，在3β-HSD、17α-羥化酶、17,20-碳鏈裂解酶、17β-HSD等的系列催化作用下轉(zhuǎn)變成睪酮。本研究對(duì)StAR、P450scc和3β-HSD的編碼基因Star、Hsd3b1、Cyp11a1表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE暴露可導(dǎo)致TM3細(xì)胞Star、Hsd3b1、Cyp11a1基因表達(dá)上調(diào)。這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果并不一致。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，ACE暴露可導(dǎo)致睪丸組織中睪酮合成關(guān)鍵酶基因Star、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd17b1等的mRNA表達(dá)顯著降低[15-16]。體內(nèi)外結(jié)果的不一致性可能與ACE代謝有關(guān)，在體內(nèi)，ACE可以代謝為N-去甲基啶蟲脒，該代謝產(chǎn)物可能在ACE致生殖毒性機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但一項(xiàng)對(duì)143例18～40歲的男性農(nóng)業(yè)工人的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，尿液中N-去甲基啶蟲脒水平與雄烯二酮水平呈正相關(guān)，吡蟲啉水平與睪酮、脫氫皮質(zhì)酮和脫氫表雄酮水平呈正相關(guān)，推測(cè)NEOs具有潛在的促類固醇生成活性[17]。這與本文研究結(jié)果相一致。因此，ACE等NEOs對(duì)哺乳動(dòng)物睪酮合成的影響還需深入研究。

綜上所述，ACE暴露可通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，同時(shí)，ACE可通過上調(diào)Star、Hsd3b1、Cyp11a1基因表達(dá)影響睪酮合成過程。但相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，以期為ACE致生殖毒性的預(yù)防和早期干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。