王超眾, 南俊伶, 董艷麗, 王萌萌,3*
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.齊齊哈爾市藥品檢驗(yàn)中心,黑龍江 齊齊哈爾 161005;3.齊齊哈爾市第一醫(yī)院,黑龍江 齊齊哈爾 161005)
熱毒寧注射液是江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的中藥注射劑[1],由金銀花、梔子、青蒿3味藥材制成[2],具有清熱、疏風(fēng)、解毒的功效[3],用于治療外感風(fēng)熱所致感冒、咳嗽,上呼吸道感染、急性支氣管炎等疾病[4],臨床上退熱作用迅速,抗病毒效果顯著[5-6],屬于國(guó)家二類新藥[7-8],并在治療急性氣管炎、上呼吸道感染方面取得了一定療效[9-11]。在新冠肺炎疫情流行期間,熱毒寧注射液已被廣泛應(yīng)用于危重型患者的治療[12-15],故有必要對(duì)該制劑進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。
在熱毒寧注射液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中,分別采用2個(gè)HPLC系統(tǒng)測(cè)定梔子苷、綠原酸的含量,操作繁瑣,另外還有應(yīng)用高效毛細(xì)管電泳法[16]、紫外分光光度法[17]、高效液相色譜法[18-20]、超高效液相色譜法[21]等手段進(jìn)行含量測(cè)定,但尚無關(guān)于超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)法的相關(guān)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)建立UHPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定熱毒寧注射液中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸的含量,符合中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展趨勢(shì)[22],可為該制劑用藥安全提供可靠的技術(shù)保障。
1.1 儀器 Thermo Vanquish H型高效液相色譜儀(配置Xcalibur 3.0.63工作站)、Thermo TSQ Quantum Access型質(zhì)譜儀(配置Chromeleon 7.2.10工作站)(美國(guó)Thermo公司);BP211D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司,精度0.01 mg);KQ-500VDV型臺(tái)式三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率500 W,頻率45 kHz);DFY-400型高速萬能粉碎機(jī)(上海比朗儀器有限公司)。
1.2 試劑與藥物 梔子苷(批號(hào)110749-201919,純度97.1%)、綠原酸(批號(hào)110753-202018,純度96.1%)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院);京尼平龍膽雙糖苷(批號(hào)7382,純度≥98.0%)、新綠原酸(批號(hào)7864,純度≥98.0%)對(duì)照品(上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司);隱綠原酸對(duì)照品(成都普思生物科技股份有限公司,批號(hào)PS14011403,純度≥99.0%)。熱毒寧注射液(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)210601、210824、190805)。乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;水為超純水。
2.1 UHPLC-MS/MS分析條件 ACES C18Dim色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相乙腈(A)-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)(B),梯度洗脫(0~7 min,5%~25%A;7~9 min,25%~65%A;9~10 min,65%~100%A;10~12 min,100%A);體積流量0.3 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量1 μL;電噴霧離子源,正負(fù)離子檢測(cè);選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式;霧化氣N2;鞘氣體積流量10 bar(1 bar=100 kPa);輔助氣體積流量30 bar;源電壓4 000 V(+)、3 500 V(-);毛細(xì)管溫度270 ℃,其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)
2.2 溶液制備
2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品適量,50%甲醇制成1 mg/mL溶液,分別精密量取適量,50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.022 5、0.505 7、0.802 4、0.301 8、0.301 0 μg/mL的貯備液,分別精密量取2 mL,置于10 mL量瓶中,50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,即得。
2.2.2 供試品溶液 精密量取本品1 mL,置于50 mL量瓶中,50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密量取0.2 mL,置于200 mL量瓶中,50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,即得。
2.2.3 空白溶液 取50%甲醇,濾過,即得。
2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、空白溶液適量,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見圖1。由此可知,供試品溶液色譜圖中各成分保留時(shí)間與對(duì)照品溶液一致,空白色譜圖無干擾峰出現(xiàn),表明該方法系統(tǒng)適應(yīng)性良好。
2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液,50%甲醇依次稀釋100、50、20、10、5、2.5、2倍,得到含梔子苷10.22、20.45、51.12、102.25、204.49、408.99、511.230 ng/mL,京尼平龍膽雙糖苷5.06、10.11、25.28、50.57、101.14、202.27、252.84 ng/mL,綠原酸8.02、16.05、40.12、80.24、160.49、320.97、401.22 ng/mL,新綠原酸3.02、6.04、15.09、30.18、60.37、120.74、150.92 ng/mL,隱綠原酸3.01、6.02、15.05、30.10、60.19、120.38、150.48 ng/mL的對(duì)照品溶液,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,結(jié)果見表2,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
表2 各成分線性關(guān)系
2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸峰面積RSD分別為1.21%、2.06%、1.07%、1.56%、0.97%,表明儀器精密度良好。
2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)210601)適量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、2、6、10、16、24 h在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸峰面積RSD分別為3.47%、4.26%、2.59%、2.67%、3.13%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)210601)適量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,平行6份,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量RSD分別為2.10%、1.69%、1.36%、2.08%、1.57%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的本品(批號(hào)210601)0.5 mL,共6份,置于50 mL量瓶中,分別精密加入“2.1”項(xiàng)下1 mg/mL溶液5、2.5、3.3、1.2、1.3 mL,50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密量取0.2 mL,置于200 mL量瓶中,50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表3。
表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算各成分含量,結(jié)果見表4。
表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL,n=3)
3.1 紫外檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器比較 熱毒寧注射液組成復(fù)雜,雜質(zhì)峰對(duì)主峰影響較大,并且5種成分檢測(cè)波長(zhǎng)不同,紫外檢測(cè)器很難做到同時(shí)檢測(cè)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)譜檢測(cè)器,可使結(jié)果更準(zhǔn)確。
3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-10 mmol/L醋酸銨、乙腈-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸),發(fā)現(xiàn)乙腈-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)洗脫時(shí)效果較好。
3.3 檢測(cè)離子選擇 梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷均為環(huán)烯醚萜類化合物[23],在本實(shí)驗(yàn)條件下得到1個(gè)氨基,形成m/z406.2、568.4的[M+NH4]+準(zhǔn)分子離子峰,碰撞后裂解的二級(jí)質(zhì)譜中m/z209.2峰響應(yīng)值最高,即兩者共有子離子[C11O4H13]+;綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸主要為咖啡酸、香豆酸、福林酸與奎寧酸形成的縮合型酚酸,由于酯化部位及酸酐種類、數(shù)量的不同,使得綠原酸類物質(zhì)形成了以上3種同分異構(gòu)體[24],在本實(shí)驗(yàn)條件下易失去1個(gè)質(zhì)子,形成m/z353.1的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰,碰撞后裂解的二級(jí)質(zhì)譜中m/z191.1峰響應(yīng)值最高,即三者共有子離子[C7O6H11]-。
本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定熱毒寧注射液中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸的含量,該方法準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,靈敏度高,可為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。