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    額日赫木-8散HPLC指紋圖譜建立及秦皮乙素測定

    2022-12-03 06:15:26趙宇郁尚亞倩馬桂芝
    中成藥 2022年8期
    關(guān)鍵詞:秦皮號峰乙素

    徐 楠, 趙宇郁, 張 偉, 尚亞倩, 馬桂芝*, 滕 亮

    (1.新疆醫(yī)科大學藥學院,新疆 烏魯木齊 830011;2.廣東藥科大學醫(yī)藥商學院,廣東 廣州 510006;3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部,新疆 烏魯木齊 830054)

    額日赫木-8散為新疆維吾爾自治區(qū)博州蒙醫(yī)醫(yī)院制劑,出自《四部醫(yī)典》,又稱清熱八味散,由紅花、黃連、紫花地丁、麥冬、人工牛黃、檀香、瞿麥、石膏、冰糖組成[1],具有清熱解毒之效,可增強正常小鼠免疫反應(yīng)[2],聯(lián)用三臣丸對小兒上呼吸道感染高熱效果顯著[3],還可作為SARS治療的輔助用藥[4]。

    目前,額日赫木-8散質(zhì)量標準僅有性狀描述,無法全面反映其整體質(zhì)量狀況,也不能保證其臨床應(yīng)用安全性和有效性;相關(guān)質(zhì)量控制文獻也主要集中在TLC鑒別[5]和有效成分定量測定[6-9]方面,無法準確全面評價該制劑質(zhì)量。中藥指紋圖譜能系統(tǒng)全面地反映中藥品質(zhì)的真實性、一致性、穩(wěn)定性,結(jié)合化學模式識別可全面獲得其質(zhì)量信息,故在中藥制劑的質(zhì)量控制中被廣泛應(yīng)用[10-12]。

    本實驗建立了額日赫木-8散HPLC指紋圖譜,并結(jié)合化學模式識別評價不同批次樣品的一致性和穩(wěn)定性,找出差異性成分。同時,采用2020年版《中國藥典》中《藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則》相關(guān)要求,建立主要藥材紫花地丁中秦皮乙素含量的測定方法,以期為提高全方質(zhì)量控制水平奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜儀,配置SPD-M20A 230 V光電二極管陣列紫外可見光檢測器、πNAP COSMASIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(日本島津公司);New Classic MF分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司,0.01 mg);KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率250 W,頻率50 kHz);Milli-Q艾柯超純水儀(美國密理博公司);Agilent SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(美國安捷倫科技公司)。

    1.2 試劑與藥物 檀香(批號170805)、紅花(批號170308)、黃連(批號170518)、紫花地丁(批號170618)、麥冬(批號160116)、人工牛黃(批號160101)、瞿麥(批號170716)、石膏(批號170718)、冰糖(批號141620)均由新疆博州蒙醫(yī)醫(yī)院提供,經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院劉冰主任中藥師鑒定為正品。羥基紅花黃色素A對照品(批號MUST17082905,純度≥98%)購自成都曼思特生物科技有限公司;秦皮乙素對照品(批號C25J7Y18390,純度≥98%)、阿魏酸對照品(批號20130301,純度≥98%)均購自上海源葉生物科技有限公司。額日赫木-8散(新疆博州蒙醫(yī)醫(yī)院,批號20170915、20171201、20180208、20180410,供含量測定用;批號20180822、20180917、20181024、20181119、20181213、20190104、20190225、20190318、20190423、20190526,編號S1~S10,供指紋圖譜建立用)。甲醇為色譜純(美國Sigma公司);其他試劑均為分析純(天津永晟精細化工有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 HPLC指紋圖譜建立

    2.1.1 溶液制備

    2.1.1.1 對照品溶液 精密稱取秦皮乙素、羥基紅花黃色素A、阿魏酸對照品適量,60%甲醇溶解,即得。

    2.1.1.2 供試品溶液 精密稱取本品適量,置于25 mL量瓶中,精密加入60%甲醇20 mL,超聲處理20 min,取出,放冷,60%甲醇定容至刻度,搖勻,靜置,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

    2.1.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例及制備工藝,精密稱取除紫花地丁外的其余藥材,按“2.1.1.2”項下方法制備,即得。

    2.1.2 色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相0.1%磷酸(A)-甲醇(B),梯度洗脫(0~20 min,85%~75%A;20~25 min,75%~70%A;25~30 min,70%A;30~40 min,70%~80%A;40~45 min,80%~71%A;45~68 min,71%A;68~85 min,71%~72%A;85~100 min,72%~75%A;100~105 min,75%~85%A;105~110 min,85%A);體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長345 nm;進樣量10 μL。

    2.1.3 方法學考察

    2.1.3.1 精密度試驗 精密稱取本品1 g,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定6次,以4號峰(秦皮乙素)為參照,測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%,表明儀器精密度良好。

    2.1.3.2 重復性試驗 精密稱取本品1 g,共6份,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定,以4號峰(秦皮乙素)為參照,測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%,表明該方法重復性良好。

    2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取本品1 g,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,于0、1.5、3、4.5、6、7.5、9 h在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定,以4號峰(秦皮乙素)為參照,測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%,表明溶液在9 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.1.4 圖譜生成 取10批樣品,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定,采用“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”(2012.13723版本),以S1為參照圖譜,采用中位數(shù)法,經(jīng)多點校正后得到指紋圖譜共有模式,選擇分離度和重復性良好、特征明顯的17個色譜峰作為共有峰,生成對照圖譜,見圖1~2,相似度見表1,發(fā)現(xiàn)均大于0.9,提示各批次之間成分一致性理想。

    圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜

    圖2 共有峰對照圖譜

    選擇保留時間穩(wěn)定、峰面積適宜、分離度和對稱性良好的4號峰(秦皮乙素峰)作為參照,測得各共有峰相對保留時間RSD均小于0.45%,表明其出峰時間較穩(wěn)定,但其相對峰面積RSD相差較大,表明存在一定批間差異。

    2.1.5 色譜峰歸屬 按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定,通過與對照品色譜圖保留時間和全波長紫外掃描圖譜比對,發(fā)現(xiàn)4號峰為秦皮乙素,5號峰為羥基紅花黃色素A,9號峰為阿魏酸,見圖3。

    1.秦皮乙素 2.羥基紅花黃色素A 3.阿魏酸1. esculeyin 2. hydroxylaffin A 3. ferulic acid

    2.2 化學模式識別

    2.2.1 聚類分析 采用組間平均聯(lián)接法,以平方Euclidean距離為測度,對10批樣品共有峰峰面積進行聚類分析[13-16],結(jié)果見圖4。由此可知,類間距為5時,各批樣品聚為3類,S2~S9為一類,S1、S10各一類;不同批次樣品之間各成分含量存在差異,可能是由于生產(chǎn)工藝及原材料采收、加工、產(chǎn)地所致[12-15]。

    圖4 10批樣品聚類分析樹狀圖

    2.2.2 主成分分析 對10批樣品共有峰峰面積進行因子分析,結(jié)果見表2。由此可知,3個主成分累積方差貢獻率為91.677%,可代表樣品大部分信息;以絕對值大于0.5為重要性標準,4號峰(秦皮乙素)、9號峰、7號峰對2個及2個以上主成分的貢獻較大。

    表2 主成分因子載荷矩陣

    根據(jù)文獻[16]報道計算10批樣品綜合得分F,公式為F=0.529F1+0.369F2+0.102F3,結(jié)果見表3。

    表3 10批樣品綜合得分及排序

    采用 SIMICA 14.1軟件進行主成分分析,結(jié)果見圖5~6。由此可知,質(zhì)量參數(shù)(R2X)、預測度(Q2)均大于0.5,表明模型預測性較好[13-17];前2個主成分貢獻率最大,累積貢獻率達85.568%。另外,圖6所得結(jié)果與表2一致。

    圖5 主成分分析散點得分圖

    圖6 主成分分析載荷圖

    2.2.3 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 將10批樣品共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件,采用PLS-DA模型,經(jīng)Permutatons驗證,得到Q2為負值,表明模型可靠,不存在過度擬合現(xiàn)象,建模成功[12,14-15]。得分散點圖見圖7,可知相似度高的樣品聚合為一類,與主成分分析結(jié)果基本一致。載荷圖見圖8,距離原點越遠的點權(quán)重值越大,在區(qū)分樣本中的作用越大。圖9顯示,在95%置信區(qū)間內(nèi)4號峰(秦皮乙素)、10號峰、12號峰、15號峰的變量重要性投影值(VIP值)均大于1,為引起批次間差異的主要標志性成分。

    圖7 偏最小二乘判別分析散點得分圖

    圖8 偏最小二乘判別分析載荷圖

    圖9 偏最小二乘判別分析VIP值圖

    2.3 秦皮乙素含量測定 主成分分析、偏最小二乘判別分析顯示,4號峰(秦皮乙素)變化既可影響質(zhì)量評分,也是引起批次差異的主要標志性成分,故對其含量進行測定[17-19]。

    2.3.1 色譜條件 πNAP COSMASIL C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;流動相甲醇(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0~28 min,75%B;29~41 min,45%B;42~51 min,60%B;52~60 min,75%B);體積流量1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長345 nm;進樣量10 μL,色譜圖見圖10。由此可知,秦皮乙素色譜峰與其他成分色譜峰達到基線分離,分離度大于1.5,理論塔板數(shù)大于7 000,陰性無干擾,表明該方法專屬性良好。

    1.秦皮乙素1.aesculetin

    2.3.2 方法學考察

    2.3.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1.1”項下對照品溶液,依次倍量稀釋,得到系列質(zhì)量濃度,分別精密吸取10 μL,在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進行回歸,得方程為Y=30 415X-2 470.1(r=0.999 9),在0.414 1~106 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.3.2.2 精密度試驗 精密稱取本品1.0 g,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次,測得秦皮乙素峰面積RSD為0.28%,表明儀器精密度良好。

    2.3.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取本品1.0 g,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,常溫下于0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定,測得秦皮乙素峰面積RSD為0.70%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.3.2.4 重復性試驗 精密稱取本品1.0 g,按“2.1.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定,測得秦皮乙素含量RSD為0.58%,表明該方法重復性較好。

    2.3.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取6份秦皮乙素含量已知的本品1.0 g,加入340 μg/mL對照品溶液,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定,計算回收率,結(jié)果見表4。

    表4 秦皮乙素加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

    2.3.3 樣品含量測定 精密稱取4批本品各1.0 g,每批3份,按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定,計算含量,結(jié)果見表5。

    2.3.4 限度確定 根據(jù)表5結(jié)果,結(jié)合紫花地丁采收季節(jié)、貯藏條件與時間、制劑生產(chǎn)水平,建議每1 g額日赫木-8散中含秦皮乙素不得低于321.2 μg/g。

    3 討論

    3.1 色譜柱選擇 預實驗發(fā)現(xiàn),Agilent SB C18色譜柱可實現(xiàn)更多色譜峰的較好分離,符合指紋圖譜宏觀研究目的,故本實驗選擇其進行額日赫木-8散HPLC指紋圖譜研究。另外,πNAP C18色譜柱雖然分析時間相對較長,但秦皮乙素分離度良好,可能與其硅膠固定相上鍵合的萘乙基有關(guān),故本實驗選擇其進行各成分含量測定。

    表5 秦皮乙素含量測定結(jié)果(n=3)

    3.2 化學模式識別與含量測定研究 本實驗采用3種化學模式識別方法[20-21],其中聚類分析表明,當類間距為5時,10批樣品聚為3類,提示各批樣品之間雖然相似度較高,但卻仍存在差異;PCA表明,3個主成分的累積方差貢獻率為91.677%,可代表樣品大部分信息,但與聚類分析結(jié)果存在一定差異,可能與評價指標[13]不同有關(guān);通過比較主成分和差異性質(zhì)量標志物,確認秦皮乙素(4號峰)為共同標志化合物。秦皮乙素具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[22-23],與額日赫木-8散傳統(tǒng)功效密切相關(guān),故選擇該成分作為含量測定指標。

    4 結(jié)論

    本實驗建立額日赫木-8散HPLC指紋圖譜,并測定秦皮乙素含量,該方法簡便準確,可為控制全方質(zhì)量提供參考。

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