芩柏湯通過調(diào)節(jié)TLR2/IκB-α/IL-1β通路保護(hù)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的研究

劉 雯， 侯晨輝， 李 江

(1.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河南 鄭州 451460；2.河南省天然藥物提取和醫(yī)療技術(shù)應(yīng)用工程研究中心，河南 鄭州 451460)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種臨床常見的慢性非特異性炎癥性疾病，我國患病率約為1/10 000[1]，在潰瘍性結(jié)腸炎患者中，約46%的患者表現(xiàn)為慢性復(fù)發(fā)型，病情反復(fù)，遷延難愈[2]。近年來中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究得到了長足的進(jìn)展，其優(yōu)勢也逐漸被認(rèn)可[3-4]。芩柏湯是根據(jù)芩柏顆粒組方加減所得的中藥湯劑，可清熱燥濕、活血化瘀、潤腸通便，有研究顯示芩柏湯治療潰瘍性結(jié)腸炎有確切效果，可保護(hù)結(jié)腸黏膜[5]。Toll樣受體2(TLR2)可通過細(xì)胞膜外區(qū)富含亮氨酸的重組序列識別配體，進(jìn)而激活相關(guān)接頭蛋白，上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的表達(dá)，與此同時核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)磷酸化水平升高，可解離NF-κB的復(fù)合物，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生持續(xù)擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)，并增加白介素-1β(IL-1β)表達(dá)[6-7]。有研究顯示，抑制TLR2/IκB-α/IL-1β通路中TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1β表達(dá)可降低血清IL-1β、IL-4水平，升高IL-10水平，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)潰瘍性結(jié)腸炎模型的腸黏膜[8-10]。因此，本展開了對芩柏湯保護(hù)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的機(jī)制研究。

1 材料

1.1 動物 54只清潔級SD成年大鼠，7～9周齡，雌雄各半，體質(zhì)量184～226 g，購自上海加科生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，自由飲食(標(biāo)準(zhǔn)飼料)與進(jìn)水(高壓滅菌水)，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。參照3R原則設(shè)計實驗，本實驗已經(jīng)河南省實驗動物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過[(準(zhǔn)字)R201902-003]。

1.2 試劑與藥物 美沙拉嗪(葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號190516)；芩柏湯藥材(廣東省惠州市中藥廠有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)紀(jì)寶玉副教授鑒定合格)。大鼠血清IL-1β、IL-4、IL-10酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號20200710A、20200412C、20200318A)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，批號200613)；TRIzol試劑(北京萊博潤科生物科技有限公司，貨號R20200127)；兔抗鼠TLR2、IκB-α、NF-κB、IL-1β、p-IκB-α單抗，羊抗兔TLR2、IκB-α、NF-κB、IL-1β、p-IκB-α多抗(英國Abcam公司，批號20200113、20200221、20200117、20200312、20200514，20200226、20200126、20200415、20200412、20200511)。三硝基苯磺酸(TNBS)(北京譜朋科技有限公司，貨號200111)；無水乙醇(貨號G20200418)。

1.3 儀器 2164型超凈工作臺(美國BioX科技有限公司)；LC-2030型高效液相色譜儀(日本島津公司)；硅膠管(東莞泰同實業(yè)有限公司)；AB126型大鼠保溫?zé)?北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；BH2-UMA型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；T100型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀、Turbo型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；Mixer型勻漿儀(美國OMNI公司)；NanoDrop型超微量紫外線分光光度計(美國Thermo公司)；LKB2050型蛋白質(zhì)電泳儀(瑞典pharmacia LKB公司)；PHOTOCHEM型化學(xué)發(fā)光儀(德國耶拿分析儀器股份有限公司)。

2 方法

2.1 芩柏湯制備 稱取黨參、炒白術(shù)、生黃芪各20 g，當(dāng)歸、丹參各12 g，黃芩、黃柏、秦艽、防風(fēng)、澤瀉、制大黃、玄胡各10 g，桃仁6 g，加水浸泡30 min，煎煮30 min，取200 mL煎煮液，同法再次煎煮取200 mL煎煮液，混勻后過濾，水浴加熱濃縮至每1 mL含1 g生藥。

2.2 造模、分組與給藥 將54只SD大鼠隨機(jī)分為2組，其中9只記為正常組，余45只采用TNBS/乙醇聯(lián)合法建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型[11]，造模前禁食不禁水24 h，取5% TNBS與無水乙醇1∶1混合，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，取經(jīng)過石蠟油潤滑的硅膠管(長約12 cm，直徑2.0 mm)，經(jīng)肛門輕插入大鼠體內(nèi)約8 cm，將上述混合液按照100 mg/kg劑量經(jīng)硅膠管注入，正常組同法注入等量生理鹽水，均提起尾部倒置10 min后仰臥歸籠，保溫?zé)粽丈渲链笫笞匀惶K醒。3 d后于造模大鼠中隨機(jī)取1只頸椎脫臼法處死，經(jīng)病理檢查確認(rèn)是否造模成功。將剩余造模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即模型組，美沙拉嗪組，芩柏湯低、中、高劑量組。美沙拉嗪組予以5%美沙拉嗪混懸液2 mL灌腸，芩柏湯低、中、高劑量組予以6%、12%、24%芩柏湯混懸液2 mL灌腸，模型組和正常組予以蒸餾水2 mL灌腸，每天2次，共給藥3周。

2.3 疾病活動指數(shù)(DAI)評價大鼠一般情況 將體質(zhì)量下降率<1%、≥1%且<5%、≥5%且<10%、≥10%分別評為0、1、2、3分；將大便性狀正常、略松散、松散、腹瀉分別評為0、1、2、3分；將大便正常、隱血陽性、肉眼出血、血便分別評為0、1、2、3分，計算上述3項評分總和，得分越高認(rèn)為病情越嚴(yán)重[12]。

2.4 Luk評分評價大鼠結(jié)腸病變 脊椎脫臼法處死大鼠，取結(jié)腸剪開并以生理鹽水沖洗，腸黏膜層向上平鋪，觀察其色澤、充血、糜爛及潰瘍等情況。將無損傷、充血且無潰瘍，充血且腸壁增厚但無潰瘍，有1處潰瘍但無腸壁增厚，有2處或以上潰瘍/炎癥，有2處或以上大潰瘍和炎癥，有1處潰瘍/炎癥沿結(jié)腸縱軸>1 cm分別評為0、1、2、3、4、5分；若沿腸縱軸損傷>2 cm，每超過1 cm增加1分(6～10分)[13]。

2.5 ELISA法檢測血清炎癥因子水平 取大鼠尾靜脈血，3 500 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取上清液采用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β、IL-4、IL-10水平。

2.6 HE染色觀察結(jié)腸黏膜病理變化 取大鼠結(jié)腸黏膜組織，中性甲醛固定，梯度乙醇脫水后透明、包埋，連續(xù)切片(5 μm)，蘇木素染色，伊紅復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片后高倍光鏡下觀察。

2.7 RT-qPCR法檢測結(jié)腸黏膜TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關(guān)基因mRNA表達(dá) 取大鼠結(jié)腸黏膜組織研磨勻漿，TRIzol法提取總RNA，采用超微量紫外線分光光度計定量后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其作為模板擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；最后54 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCT法計算TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA相對表達(dá)。引物序列委托寶生物工程(大連)有限公司合成，具體信息見表1。

表1 引物信息

2.8 Western blot法檢測結(jié)腸黏膜TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取大鼠結(jié)腸黏膜組織提取總蛋白并定量，取50 μg上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，暗室加發(fā)光劑，曝光后采用化學(xué)發(fā)光儀成像，并采用IPP6.0圖像分析軟件分析蛋白相對表達(dá)量及磷酸化水平。胞核NF-κB蛋白表達(dá)檢測內(nèi)參為H3，TLR2、IκB-α、胞漿NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達(dá)檢測內(nèi)參為GAPDH。

3 結(jié)果

3.1 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織病理情況 造模大鼠結(jié)腸黏膜及其下層有充血、水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象，符合潰瘍性結(jié)腸炎典型病理表現(xiàn)，見圖1。

3.2 芩柏湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI、Luk評分的影響 給藥前后與正常組比較，各組大鼠DAI評分均升高(P<0.01)。給藥后與正常組比較，模型組大鼠DAI、Luk評分均升高(P<0.01)；與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組DAI、Luk評分均降低(P<0.01)；與美沙拉嗪組比較，芩柏湯中、高劑量組DAI、Luk評分均降低(P<0.01)，見表2。

注：A為肉眼觀察結(jié)腸，B為結(jié)腸HE染色(×400，標(biāo)尺50 μm)。藍(lán)色箭頭指示結(jié)腸黏膜水腫，紅色箭頭指示黏膜下層充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤。

表2 各組大鼠DAI、Luk評分比較(分,

3.3 芩柏湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清炎癥因子水平的影響 給藥前后與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-4水平均升高(P<0.01)，血清IL-10水平均降低(P<0.01)；給藥后與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組血清IL-1β、IL-4水平均降低(P<0.01)，血清IL-10水平均升高(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠給藥前后血清炎癥因子水平比較

3.4 芩柏湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織病理變化的影響 正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織可見黏膜全層結(jié)構(gòu)和血管紋理清晰，腺體規(guī)則排列，上皮細(xì)胞整齊緊密，杯狀細(xì)胞豐富；模型組可見黏膜及其下層大量炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞排列稀疏，大量腺體破壞，杯狀細(xì)胞極少，有肉芽組織形成，且有嚴(yán)重充血、水腫、糜爛和潰瘍表現(xiàn)；美沙拉嗪組和芩柏湯低劑量組可見部分炎性細(xì)胞浸潤，組織有充血水腫，可見少量糜爛及潰瘍；芩柏湯中劑量組可見少部分炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞排列整齊，有充血、水腫；芩柏湯高劑量組可見極少炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞排列整齊緊密，杯狀細(xì)胞豐富，有輕微充血、水腫，見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理變化(HE染色，×400，標(biāo)尺50 μm)

3.5 芩柏湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA表達(dá)均升高(P<0.01)；與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組結(jié)腸黏膜組織以上指標(biāo)mRNA表達(dá)均降低(P<0.01)；與美沙拉嗪組比較，芩柏湯中、高劑量組結(jié)腸黏膜組織以上指標(biāo)mRNA表達(dá)均降低(P<0.01)，見表4。

3.6 芩柏湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR2、IκB-α、胞核NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)，p-IκB-α/IκB-α蛋白表達(dá)比值與胞漿NF-κB蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)；與模型組比較，美沙拉嗪組和芩柏湯各劑量組結(jié)腸黏膜組織TLR2、IκB-α、胞核NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)，胞漿NF-κB均升高(P<0.01)，芩柏湯中、高劑量組p-IκB-α/IκB-α蛋白表達(dá)比值均升高(P<0.05，P<0.01)，見圖3～4、表5。

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1β mRNA表達(dá)比較

圖3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR2、IκB-α、胞漿NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表達(dá)

圖4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織胞核NF-κB蛋白表達(dá)

4 討論

美沙拉嗪屬于柳氮磺胺砒啶治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性成分，因此本研究選用其作為對照藥物[14]，但其僅對輕中度潰瘍性結(jié)腸炎患者有效[15]。中醫(yī)將潰瘍性結(jié)腸炎歸屬于“泄瀉”“腸癖”范疇，脾氣虛弱，濕邪旺盛，濕蘊化熱，血分受累，及肝腎，易致血瘀[16]；腸癖多因氣虛夾濕、氣血瘀滯、久病入絡(luò)，則病程蔓延，遷延難愈，形成“虛中有實”“虛實夾雜”之癥[17]。因針對此類病癥應(yīng)以健脾益氣、補(bǔ)虛祛濕為重，兼活血祛瘀。

表5 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織TLR2/IκB-α/IL-1β通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

本研究發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪和芩柏湯均可改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的一般狀況，減輕結(jié)腸黏膜病理改變和炎癥反應(yīng)。芩柏湯中黨參健脾益氣、生津潤燥，將黨參、黃芪合用益氣扶正、托毒外出；白術(shù)甘溫補(bǔ)中、溫苦燥濕，兼具益氣補(bǔ)脾、行水燥濕之效；黃芩、黃柏合用清熱燥濕、祛火解毒；丹參活血化瘀、行氣祛瘀；以玄胡、防風(fēng)、秦艽、澤瀉佐之，玄胡行氣活血，防風(fēng)祛風(fēng)止痛，秦艽勝濕健脾，澤瀉利水滲濕；大黃為使藥，瀉火解毒、導(dǎo)熱外出、涼血祛瘀。諸藥合用，共奏健脾補(bǔ)虛、祛瘀除濕之效。此外，黨參可抗?jié)儯迯?fù)受損的腸黏膜，還可減輕炎癥反應(yīng)[18]；黃芪可調(diào)節(jié)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫，降低血清促炎因子水平，改善腸黏膜功能[19]。因此芩柏湯治療潰瘍性結(jié)腸炎有確切效果。

目前TLRs介導(dǎo)的免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中得到了廣泛關(guān)注[20-21]。TLR2可識別配體，導(dǎo)致IκB-α被激活，調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄[22-24]。Bank等[25]證實抑制TLR2表達(dá)可減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織炎癥浸潤。IκB-α，發(fā)生磷酸化進(jìn)而從NF-κB中解離，NF-κB暴露核定位點，使得胞漿中的NF-κB迅速向細(xì)胞核移位，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，增加IL-1β表達(dá)。過量的TLR2可導(dǎo)致NF-κB過度激活，產(chǎn)生持續(xù)擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)，使得促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-4水平增加，而IL-10水平降低[26-27]，本研究結(jié)果與上述報道相符。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組IκB-α、p-IκB-α蛋白表達(dá)均較正常組升高，而p-IκB-α/IκB-α較正常組降低，與上述趨勢相反，可能是因為潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜組織在發(fā)生炎癥反應(yīng)同時，可能也存在拮抗炎癥的自我保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，中、高劑量芩柏湯可降低p-IκB-α表達(dá)，下調(diào)胞核NF-κB蛋白表達(dá)，增加胞漿NF-κB蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，可能是通過抑制該通路減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)和病理損傷。

綜上所述，美沙拉嗪和芩柏湯均可減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜病變和炎癥反應(yīng)，且中、高劑量芩柏湯的效果優(yōu)于美沙拉嗪，推測該方劑可能是通過抑制TLR2/IκB-α/IL-1β通路減輕炎癥反應(yīng)。